研究背景：急性白血病(acute leukemia, AL)是一种获得性造血干细胞异常造成的恶性增殖性疾病,目前发病率约为2.76/10万,是最常见的血液系统恶性肿瘤之一。尽管联合化疗、免疫治疗如CAR-T、干细胞移植及靶向药物治疗等治疗策略的进展,除了70～80%的儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)能够治愈,其他类型AL长期无病生存率(Disease-Free Survival, DFS)仅为30-40%,远期预后差。因此针对白血病治疗的新的药物、新的治疗手段越来越重要。近年来有人提出了肿瘤的诱导分化治疗。它的理论基础是引起细胞分化受抑的相关基因在一定条件下是可逆的,肿瘤的子代细胞,在一定条件和环境下也可被诱导而再次向成熟细胞分化[2]。它改变了既往的治疗思路,区别于手术切除或以放射线、细胞毒药物等直接杀伤肿瘤细胞,而是逆转其分化受抑,诱导肿瘤细胞进一步成熟分化为正常细胞或接近正常细胞。在此理论指导下全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(AS2O3)相继应用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)并取得了突破性进展,是目前诱导分化治疗恶性疾病的第一个成功模型,也是研究和应用最多的。但是,随着临床应用病例的不断扩大,二者都存在疗效的个体差异、耐药性、复发率和变异综合症等其他不同程度的毒副作用,甚至部分患者治疗失败。到目前为止,ATRA及AS2O3主要对APL有效,对非M3型急性髓系白血病(AML)或其他肿瘤治疗无效,或效果不突出。其他常见的诱导分化剂如维生素D3、干扰素及细胞因子类等由于自身的各种局限性阻止了在临床肿瘤治疗中的广泛应用。因此,迫切需要寻找新的毒性小、选择性强的诱导分化剂来满足临床需要。海洋中药是中药的重要组成部分,是指来源于海洋中的用于预防和治疗疾病的天然药物,体外试验证实有些海洋中药有抗肿瘤及诱导肿瘤细胞分化的作用。泥蚶的提取物(Tegillarca granosa)作为一种传统海洋中药用于治疗肿瘤性疾病及其他慢性疾病已有1000多年的历史,它富含多肽类及维生素B12,具有抗肿瘤、抗病毒和细菌、免疫调节等多方面的作用,且长期的食用证明其无毒副作用。海生素(haishengsu, HSS)是近年来应用现代生物技术从海洋生物泥蚶软体中提取出的一种小分子糖多肽类物质,体外试验证实对肾癌细胞、白血病细胞有明显的抑制增殖作用,并可通过bcl/bax、 Fas/FasL等通路诱导细胞凋亡,临床试验也证实HSS可显著增强白血病患者的化疗的敏感性。然而这些研究大多集中在实体瘤方面或是本身的抑制肿瘤增殖、增强化疗敏感性方面,对于HSS是否可诱导肿瘤细胞成熟分化及机制尚未有研究报道到。目前为止,对于HSS对HL-60细胞是否存在诱导分化作用及具体机制,还没有系统的说明。本研究以HL-60细胞为体外分化诱导模型,观察HSS对HL-60细胞增殖及分化成熟的影响,并与最常用的诱导分化剂ATRA和AS203的作用进行比较,并初步探讨了其作用机制,以其希望寻找一种新的诱导分化和凋亡剂。目的：1.研究HSS对HL-60细胞的增殖的影响。2.研究HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用,并探讨其临床应用价值。3.阐明HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制。方法：1.研究HSS对HL-60细胞的增殖的影响。1.1分别设立实验组、空白对照组及阴性对照组：各实验组HSS浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L;空白对照组只加培养液不加细胞,阴性对照组只加细胞不加药物。1.2分别培养12h、24h、48h、72h后四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各实验组及空白对照组、阴性对照组吸光度值。1.3根据吸光度值计算增殖抑制率。1.4将不同的HSS浓度及相对应的增殖抑制率输入Graphpad Prism 5软件计算半数抑制浓度(IC50)。2.研究HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用,并同临床最常用的诱导分化剂ATRA、AS2O3在细胞增殖、细胞形态、表面分化抗原、细胞凋亡、细胞周期分布等方面进行比较,探讨其临床应用价值。2.1分别设立HSS 100mg/L组、ATRA 5umol/L组、AS2O35umol/L组及对照组,培养72小时。2.2细胞增殖：MTT法检测培养前后各实验组及对照组吸光度值,并根据吸光度值计算HL-60细胞增殖抑制率。2.3细胞形态：吉姆萨染色观察实验前后细胞大小、细胞形态、细胞核改变等2.4细胞表面分化抗原：利用FTCT标记的鼠抗人CD11b单抗,PE标记的CD 15单抗,流式细胞术分析HL-60细胞表面分化成熟的标志CD11b、CD15的表达的变化。2.5细胞凋亡：采用Annexin V/PI双染法,流式细胞检测各组HL-60细胞凋亡。2.6细胞周期分布：利用碘化丙啶(PI)染色后,流式细胞术检测各组HL-60细胞细胞周期的分布。3.HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制3.1分别设立HSS100mg/L组、ATRA5umol/L组、AS2O35umol/L组及对照组,培养72小时.3.2RT-PCR检测实验前后各组HL-60细胞中用bcl-2/bax、mpo基因的表达,主要包括细胞总RNA提取、逆转录制备cDNA、PCR反应扩增cDNA、PCR产物检测。3.3 Western blotting法检测各组细胞中bcl-2、bax蛋白的表达。3.4对各组HL-60细胞bcl-2/bax基因、蛋白表达的变化进行比较,并进行统计分析。结果：1.HSS对HL-60细胞增殖的影响HSS (0.1mg/L, 1mg/L, 10mg/L) 12h、24h、48h、72h各时间点吸光度值与对照组比较无统计学差异(P> 0.05); HSS (100mg/L,1000 mg/L) 12h吸光度值与对照组比较无统计学差异(P>0.05),24h、48h、72h各时间点吸光度值与对照组比较有统计学差异(P<0.05),与0.1、1、10 mg/L组比较也有统计学差异(P<0.05)；在100、1000 mg/L浓度下12h、24h、48h、72h各个时间点之间比较有统计学差异(P<0.05)。经Graphpad Prism 5软件分析72小时HSS作用HL-60细胞的IC50为：40mg/L。2.HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用及同ATRA、AS2O3的作用进行比较2.1对HL-60细胞增殖的影响：HSS 100mg/L. ATRA 5umol/L、AS2O3 5umol/L均对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用并呈时间效应关系。HSS组24小时、48小时、72小时增殖抑制率分别为25.23±5.13%、39.13±3.14%、70.45±8.20%；ATRA组分别为：4.56±3.31%23.20±4.32%、44.22±6.26%；AS203组分别为：4.25±3.82%、36.80±2.45%、73.62±7.28%。24小时时HSS组的增殖抑制率高于ATRA组、AS203组,差异有统计学意义(P<0.05)。48小时、72小时时高于ATRA组(P<0.05),与AS203组比较无统计学差异(P>0.05)。2.2光镜下细胞形态变化：对照组HL-60细胞体积大,大多为圆形或不规则椭圆形,细胞核大而圆,核仁清晰可见,染色质分散,胞浆嗜碱深染,细胞核和细胞浆比例增大；ATRA组HL-60细胞体积明显缩小,细胞核凹陷缩小,并转变为杆状核、肾形核甚至出现分叶核。核仁数量减少,染色质致密变粗。细胞核和细胞浆比例缩小,部分细胞发生凋亡；AS203组HL-60细胞体积缩小,细胞核凹陷缩小,部分细胞核断裂成数个大小不等的圆形颗粒,染色质嗜碱性增强,部分细胞形成凋亡小体。HSS组HL-60细胞形态表现为细胞体积明显缩小,细胞核缩小内陷,核仁数量减少,细胞核形状不规则,出现了多叶核等,细胞浆增多,核浆比例缩小,染色质变粗致密。2.3细胞表面分化抗原的变化：HSS 100mg/L、ATRA 5umol/L、AS2O3 5umol/L作用HL-60细胞72小时后,细胞表面CD11b阳性率分别为63.50±8.28%、 70.65±7.20%、18.30±2.27%,对照组为6.42±4.04%,各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05); HSS组与ATRA组比较无统计学差异(P>0.05),与AS203组比较有统计学差异(P<0.05)。CD 15在HSS组、ATRA组、AS203组和对照组分别为93.24±8.06%、93.58±6.28%、91.28±7.27%、96.50±7.24%,差异无统计学意义。2.4细胞凋亡率的变化：HSS 100mg/L, ATRA 5umol/L, AS2O35umol/L作用HL-60细胞72小时后,凋亡率分别为：38.90±3.24%、40.34±4.25%、38.18±7.20%,对照组为5.10±4.20%。各实验组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。HSS组与 ATRA、AS2O3组比较均无统计学差异(P>0.05)。2.5细胞周期分布：经HSS 100mg/L作用HL-60细胞72小时后G0/G 1期、S期、G2/M期细胞比例分别为：67.8±5.2%、26.5±3.8%5.7±2.0%,对照组为40.1±4.0%、50.2±1.4%、9.7±2.6%。HSS组大部分细胞停留在G0/G 1期,S期细胞明显减少,G2/M期细胞相对减少。HSS组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。ATRA组分别为：76.0±3.9%、18.7±2.3%、5.3±1.2%, As203组分别为72.9±2.7%、20.1±1.9%、7.0±1.5%；100mg/LHSS组与ATRA组比较,G0/G1期细胞所占比例低(P<0.05),与AS2O3组比较无统计学差异(P>0.05)。3.HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制3.1经HSS100mg/L作用HL-60细胞72小时后,HSS组HL-60细胞bcl-2基因mRNA相对表达量为0.68±0.06,对照组为0.89±0.12,HSS组bcl-2基因表达减弱,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；AS203组、ATRA组bcl-2基因表达也减弱,分别为0.81±0.16和0.73±0.29,但与对照组比较差异并无统计学意义(P>0.05), HSS组同AS203组、ATRA组比较,差异无统计学意义(P>0.05); HSS组、AS203组、ATRA组bax基因mRNA相对表达量分别为：0.89±0.15,0.50±0.05,0.89±0.06,对照组为0.18±0.07；各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 HSS组同ATRA组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但同AS203组比较,差异有统计学意义(P<0.05),要高于AS203组。3.2 HSS组、AS203组、ATRA组mpo基因]mRNA相对表达量分别为：0.44±0.14、0.86±0.08、0.83±0.15,对照组为0.95±0.17；各实验组mpo基因表达减弱,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。最明显的是HSS组,其次为ATRA组和AS2O3组；HSS组与ATRA组、AS2O3组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.3 Western blotting结果显示,HSS组、ATRA组、AS2O3组bcl-2蛋白表达量分别为：0.45±0.09、0.36±0.11、0.39±0.15,对照组为0.76±0.08,各实验组bcl-2蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。HSS组、ATRA组、AS2O3组bax蛋白表达量分别为：0.70±0.12、0.74±0.10、0.69±0.09,对照组为0.35±0.10,各实验组bax蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。 bcl-2蛋白和bax蛋白表达在各实验组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；结论：1.低浓度HSS对HL-60细胞无增殖抑制作用；较高浓度HSS24小时后对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用并呈时间、剂量效应关系。2.HSS对HL-60细胞还有诱导细胞凋亡和分化的作用。其诱导HL-60细胞凋亡及分化的能力在某些方面同ATRA、AS203类似,甚至优于ATRA、AS203；3.HSS诱导HL-60细胞凋亡及分化的机制可能涉及bcl-2／bax基因。4.HSS在有可能成为新的白血病诱导分化剂而应用于临床。当然这也需要进一步的实验特别是体内实验证实。