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目的糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的严重微血管并发症之一,现已成为导致终末期肾病的首要致病因素。由于其致病因素和环节的多样性和复杂性,DKD的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的临床治疗方案。足细胞是构成肾小球滤过屏障的重要构成组分。近年来,越来越多的研究认为足细胞损伤在DKD的发病机制中发挥重要作用。足细胞正常功能与肌动蛋白细胞骨架结构密切相关,因此,探讨疾病条件下导致细胞骨架蛋白重排的原因和内在机制,从而发现新的致足细胞损伤的线索和证据,将有助于深化对DKD发病机制的认识。血清色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)被发现在糖尿病患者体内升高,但其对DKD的病理性作用尚存争议,且具体作用机制也未能得到阐明。有文献报导,机体发生炎症反应时血清PEDF水平升高,通过调节肌动蛋白细胞骨架重排从而增加血管内皮通透性。在糖尿病肾病条件下,血清PEDF是否可能通过作用于足细胞,对足细胞骨架结构或功能产生影响,从而影响肾脏滤过屏障的完整性,目前尚不清楚。本研究旨在明确血清PEDF与DKD肾功能损伤之间的相关性,并就PEDF对足细胞结构和功能的影响及可能涉及的信号通路进行探索和讨论。材料和方法1、腹腔注射链脲佐菌素构建C57BL/6J小鼠1型及2型糖尿病模型,并根据病程周期将其分别分为5周及10周糖尿病史小鼠。2、正常小鼠、病程5周1型糖尿病小鼠尾静脉注射外源性PEDF蛋白,引起正常小鼠血清PEDF的异常升高,及糖尿病小鼠血清PEDF的进一步升高。此外,尾静脉注射重组PEDF腺相关病毒,模拟内源性PEDF的分泌增多,观察对比其与外源性PEDF注射导致的相关检测指标的差异。3、收集各组小鼠尿液标本,检测尿白蛋白/尿肌酐比值(albumin-to-creatinine ratio,ACR);采集各组小鼠血清标本,检测血清PEDF及血肌酐水平;采集各组小鼠肾脏组织,分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色显微镜下肾脏结构观察和透射电镜下肾脏微观结构观察。4、体外培养条件永生化小鼠足细胞,检测其在不同时间点给予不同浓度PEDF作用下,Transwell中异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的右旋糖酐漏出情况。5、培养条件永生化小鼠足细胞,将足细胞分为正常对照组、PEDF处理组、高糖处理组、高糖+PEDF联合处理组,观察PEDF对足细胞结构及数目的影响,包括检测Transwell中FITC-右旋糖酐漏出情况,荧光染色下F-actin形态变化,Annexin V流式细胞术中足细胞凋亡情况,蛋白印迹实验(Western blotting,WB)中闭锁连接蛋白1(Zonula occludens-1,ZO-1)、足细胞标志物nephrin及podocin蛋白表达变化。6、培养条件永生化小鼠足细胞,给予相关培养刺激后加入RhoA特异性抑制剂C3转移酶,将足细胞分为正常对照组、PEDF处理组、正常+PEDF+C3转移酶联合处理组、高糖处理组、高糖+PEDF联合处理组、高糖+PEDF+C3转移酶联合处理组,检测RhoA激活和Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil protein kinase1,ROCK1)蛋白的表达情况,并继续检测Transwell中FITC-右旋糖酐漏出情况,F-actin荧光染色形态变化,Annexin V流式细胞术中足细胞凋亡,以及WB中ZO-1、nephrin和podocin蛋白的表达变化。结果1、病程5周的1型及2型糖尿病小鼠,其血清PEDF水平、ACR均较等周龄正常小鼠明显升高,血肌酐水平无明显差异,肾脏组织HE染色下肾小囊腔与肾小球体积尚未发现明显的病理学改变,但电镜下观察到足细胞足突已发生明显的结构改变。病程10周时,糖尿病小鼠血清PEDF水平、血肌酐、ACR均较病程5周时明显升高,肾脏HE染色下肾小囊腔体积出现明显增大及肾小球体积缩小,电镜下足突融合和损伤进一步加重。2、正常小鼠注射外源性PEDF蛋白或重组PEDF腺相关病毒,血清PEDF较未注射组正常小鼠升高,且ACR及血肌酐水平随之升高,肾脏HE染色显示肾小囊腔体积较未注射组增大,肾小球体积缩小,电镜下足细胞出现足突融合;病程5周的1型糖尿病小鼠注射大剂量外源性PEDF蛋白或重组PEDF腺相关病毒,血清PEDF、ACR、血肌酐水平均较未注射组糖尿病小鼠升高,肾小囊腔体积增大,肾小球体积缩小,足突融合进一步加重。3、PEDF可导致Transwell中培养的足细胞FITC-右旋糖酐漏出增多,且漏出程度呈明显的剂量-时间依赖性。4、经高糖或外源性PEDF单独处理,足细胞细胞旁通透性增加,FITC-右旋糖酐漏出增多,ZO-1蛋白表达水平下降,应力纤维F-actin重排;同时,足细胞凋亡增多,足细胞表面特异性标志物nephrin、podocin蛋白表达水平下降。经高糖、PEDF联合处理,足细胞的以上损伤效应进一步加重。5、经高糖或外源性PEDF单独处理,可引起足细胞RhoA活化,ROCK1蛋白表达上调;经高糖、PEDF联合处理,RhoA及ROCK1蛋白的表达水平进一步增加。6、RhoA特异性抑制剂C3转移酶可改善外源性PEDF导致的足细胞细胞旁通透性增加,减少FITC-右旋糖酐的漏出,上调ZO-1蛋白的表达水平,减轻F-actin重排,减少足细胞凋亡,提高nephrin、podocin蛋白表达,降低RhoA活化及ROCK1蛋白的表达水平。结论糖尿病小鼠体内的血清PEDF水平随病程进展逐渐升高,高水平PEDF通过激活足细胞RhoA/ROCK1信号通路,诱导足细胞F-actin微丝骨架发生重排,同时促进足细胞凋亡,破坏肾小球滤过屏障的完整性,从而加速糖尿病肾病小鼠蛋白尿的发展进程及肾功能恶化。RhoA抑制剂可改善大剂量PEDF导致的足细胞损伤。本研究通过探讨升高的血清PEDF对糖尿病肾病小鼠足细胞的损伤效应及相关内在机制,可能为糖尿病肾病的临床治疗提供了新的理论依据及作用靶点。