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为获得NDV F和IBV S1重组蛋白,建立间接ELISA方法。根据NDV F和IBV S1的基因序列,设计合成特异性引物,分别构建表达NDV F蛋白和IBV S1蛋白的原核表达体系,Western blot验证结果表明重组蛋白具备良好的反应活性,可用于后续试验。为构建重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei,获得表达产物,探讨其免疫效果。本实验将NDV F及IBV S1部分抗原表位区段串联后与穿梭质粒PLA连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选阳性重组质粒,电转化至干酪乳杆菌中,构建重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei,应用PCR鉴定阳性菌株,SDS-PAGE检测重组蛋白,获得大小约78 kDa的重组蛋白,与预期结果一致,Western blot结果显示重组蛋白可与抗NDV、IBV全病毒血清结合,具有良好的反应活性,通过间接免疫荧光筛选阳性表达菌,并对其进行流式细胞术检测,随机筛选的10 000个重组菌中阳性率达96.05%,激光共聚焦检测表明蛋白成功展示于重组菌表面。试验选用14日龄雏鸡,各组免疫方式为口服+滴鼻。分别设立pLA-F-S1/L.casei两次免疫组和三次组、pLA-F/L.casei组、pLA-S1/L.casei组、商品疫苗组、pLA/L.casei组和PBS组。间接ELISA方法检测雏鸡血清IgG、肠道、鼻腔、肺脏中sIgA抗体效价,评价试验组雏鸡攻毒保护率。结果表明各免疫组IgG和sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01),pLA-F-S1/L.casei三次免疫组与两次免疫组相比,抗体滴度没有显著增长,抗体持续时间最多可有效延长至三免后第28 d。pLA-F-S1/L.casei组抗体水平与pLA-F/L.casei组和pLA-S1/L.casei组没有显著差异。末免7 d后进行攻毒试验,pLA-F-S1/L.casei组试验鸡对NDV F48E8株和IBV M41株的保护率分别为80%和90%,淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫重组菌后细胞免疫水平显著增长,显著高于pLA/L.casei组(0.05<p<0.01)和PBS组(0.01<p<0.001),因此,综合以上结果,重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei可诱导机体黏膜免疫应答、细胞免疫及体液免疫,可有效预防NDV、IBV的感染,相对于分别免疫pLA-F/L.casei和pLA-S1/L.casei,其更具经济效益,为针对该病的多价重组乳酸菌口服疫苗的研制提供重要的研究基础。