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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种重要的病原菌，按产毒素与否，可将其分为非产毒素多杀性巴氏杆菌(Non-toxingenic Pasteurella multocida，TPm)和产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxingenic Pasteurella multocida，T~+Pm)。T~-Pm往往导致猪肺疫、禽霍乱、牛羊出血性败血症等畜禽传染病；T~+Pm是猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis，AR)的主要病原菌。 用特异性荚膜抗原可将Pm分为A，B，D，E和F 5个血清群(型)；利用菌体抗原可将Pm分为1到16个菌体型。Pm的菌体最主要的外膜蛋白是OmpH，各血清型的OmpH蛋白同源性较高，而且能诱导高水平的保护性抗体。 T~+Pm产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)是一种约145kDa的皮肤坏死毒素，该毒素由toxA基因编码。T~-Pm缺少toxA基因，不能导致严重的萎缩性鼻炎症状，而只注射提纯的PMT就可以导致SPF猪出现萎缩性鼻炎症状。可见PMT在AR的产生过程中起着重要的作用。研究还表明：PMT与细胞结合并转入细胞的活性位点位于N端，而发挥毒性催化作用的位点在C端；PMT全毒素是有致病性的，而适当截短的PMT能失去致病性、保留免疫原性，可用于疫苗且比天然毒素易于获得。 本研究针对Pm及PMT主要开展了以下工作： 1、建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法，应用该检测方法并结合细菌的生化试验，从临床样品中分离鉴定了66株Pm。其中24株分离于肺脏，42株分离于鼻拭子样品。同时对每一分离菌株进行了药敏实验。 2、参照文献设计了5对PCR引物，它们是分别针对多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F 5个荚膜血清型的特异基因。从而建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR分型方法，用该方法对每一分离菌株进行了荚膜分型。结果表明，在分离的66株Pm中有46株为D型，18株为A型，1株为B型，1株无法定型，没有E、F型。在46株D型Pm中有28株分离于鼻拭子样品，18株分离于肺脏；18株A型Pm中有14株分离于鼻拭子样品，4株分离于肺脏：1株B型Pm分离于肺脏：1株未定型的Pm分离于肺脏。 3、设计了一对特异扩增T~+Pm的toxA基因的引物，建立了产毒素多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。用该方法对分离菌株进行了毒素检测，结果表明，所分离的66株Pm有8株为产毒素菌株。这8株T~+Pm都分离于有AR症状猪的鼻拭子样品，均为D型。 4、参照GenBank已发表的多杀性巴氏杆菌ompH基因序列，设计了一对引物，华中农业大学硕士毕业论文通过PCR的方法，克隆了Pm的。mPH基因，以pMD18一T为载体，构建了克隆载体pMD一口仰H并进行了序列测定。比较分析表明，所克隆的口mpH基因与NcBI上所报道的7个。呷H基因序列:us琴208、u52200、u522一3、AJ4597s5、u522ox、工二丝匹、旦业塑互的大小完全一致，为1114bP。核昔酸同源性达到%%一99%。然后构建了原核表达载体PET-o即H，转化大肠杆菌B玩，，实现了口朋卯H基因在大肠杆菌BL2.中的高效表达。表达蛋白约35kDa，W七Stem一blot检测表明，表达的蛋白具有生物学活性。 5、参照GenBank己发表的toxA基因序列，设计了一对带有酶切位点的引物，通过pCR的方法，克隆了完整的toxA基因(扩增片段为4024bp，o盯为3858bp)。构建了原核表达载体pET28b一toxA，并对其序列进行测定，比较分析表明，该才。工A基因与NCBI上所报道的5个toxA基因序列:225388、X57775、x52478、^J566llo、迷返工丝鱼的大小完全一致，核昔酸同源性都在99%以上。将表达载体pET28b一toxA转化大肠杆菌BLZ，，但是没有得到表达。然后，在质粒pET28b一toxA基础上，用酶切方法构建了4个亚克隆表达载体:①pET28b一N1513;②pET28a一1514C;③pET28b一N3 173;④pET28b一N3389，用于表达截短的toxA基因。分别转化大肠杆菌BLZ，，诱导表达。结果只有质粒①pET28b一1 513和②pET28a一1514C得到了表达，分别表达了toxA基因5’端的1 513个碱基和3’端的2345个碱基，二者相加正好是全毒素。表达蛋白分别约57kDa和87kDa，W七stem一blot检测表明，表达的蛋白具有生物学活性。 本研究分离鉴定了66株Pm，其中8株是产毒素菌株，为进一步研究提供了材料:所建立的Pm鉴定、Pm分型、T+Pm鉴定方法有助于临床诊断及细菌分离;对口mPH基因的克隆表达为研制猪多杀性巴氏杆菌病的ELISA诊断方法和新型基因工程疫苗莫定了基础;才口义A全毒素基因的克隆以及剪切后毒素基因片段的表达为研制AR的EUSA诊断方法和亚单位疫苗奠定了基础。