研究背景：食管癌是一种常见的恶性肿瘤,中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。食管癌的发生发展涉及多因素、多基因、多阶段,确诊时多为中晚期,预后极差,5年生存率仅为5%-20%。因此,探索食管癌的发病机制及安全有效的治疗方法成为食管癌治疗的关键。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进过程中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖及肿瘤的发生。端粒(telomere)作为分子钟控制着人类细胞的生长与衰老,与细胞寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA的长度会缩短55～200bp,经历多次分裂缩短至下限时,细胞最终凋亡。端粒酶(telomerase)是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。大量研究发现,在恶性肿瘤的发展中存在有端粒DNA长度的缩短,端粒酶的激活维持了癌细胞的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA的消耗,说明端粒酶在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有研究表明,人体除外少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞,大多数细胞的端粒酶都是无活性的,与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化在恶性肿瘤发生发展中起到了至关重要的作用,并且可以作为具有普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,则有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。端粒酶是由端粒酶RNA (hTR),端粒酶催化亚基(hTERT)和端粒酶相关蛋白I (TEPI)三个亚单位组成。我们曾将互补于hTR模板区的反义寡核苷酸(ASODN)作用食管癌细胞(ECA109),结果显示可抑制端粒酶活性,阻止细胞生长,但由于hTR广泛表达于正常组织细胞,针对hTR的反义治疗对正常组织细胞可能带来一定危害。新近的研究表明,hTERT是端粒酶的催化亚单位,在组织细胞中的表达量与端粒酶活性相平行,是影响端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速因子,针对hTERT的反义治疗比对hTR治疗可能更有效,靶向hTERT基因治疗显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。我们针对hTERT基因合成一段长19个碱基的反义寡核苷酸,硫化磷酸修饰(PS-ASODN),脂质体包裹,转染食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响。PinX1基因作为端粒酶的内源性基因,近几年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达水平明显下降,端粒酶活性增强。但到目前为止,PinX1基因在食管癌中的生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤有效手段,那么通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验研究采用RT-PCR,TRAP眼染法、MTT及流式细胞仪研究转染PinX1基因前后癌细胞增殖凋亡情况和端粒酶的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。以此证明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,可能通过靶向抑制端粒酶活性来影响肿瘤的发生发展,为食管癌的靶向基因治疗开辟新领域。目的：我们采用针对hTERT基因的全硫代修饰型反义寡核苷酸(PS-ASODN)转染于Eca-109人食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响,探讨其对食管癌细胞的抑制作用及机理,寻找食管癌基因治疗的新方法。本实验成功构建PinX1基因表达载体pEGFP-C3-PinX1,将其转染有高转移潜能的Eca-109人食管癌细胞,观察转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响,同时应用TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,研究PinX1基因与端粒酶的关系,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。为食管癌的基因治疗提供理论依据。方法：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；采用MTT比色法测定PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制率；采用倒置显微镜观察5μmol/L的PS-ASODN作用于Eca-109癌细胞10d后的细胞形态学改变；端粒酶活性检测采用半定量TRAP-银染法2基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；利用分子生物学技术构建针对PinX1基因的表达载体pCDNA3.1-PinX1,采用脂质体LipofectamineTM2000包装形成的脂质体-RNA复合物,转染食管癌细胞Eca109,建立稳定表达PinX1的Eca109细胞模型,应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTT方法检测转染前后细胞增殖、FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR方法检测检测PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-银染法检测转染前后各组细胞端粒酶活性,阐明PinX1基因与端粒酶活化关系。结果：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制作用具有剂量及时间依赖性和序列特异性。PS-ASDON作用后,Eca-109细胞的生长速度缓慢,细胞间连接疏松,细胞变圆漂起,细胞体积缩小。随时间延长,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强,呈时间-依赖性；随药物浓度增加,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增,呈浓度-依赖性。2基因转染PinXl对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1-PinX1重组质粒成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞, MTT法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢(P<0.05)；而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异(P>0.05)。表明pCDNA3.1-Pinx1对Eca109细胞增殖呈显著的抑制作用,以细胞在不同时间点(oh!24h!48h!72h)的OD490值绘制细胞生长曲线,并计算出的生长抑制率,说明转染PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、TRAP-银染法和FCM检测结果显示,Eca109/PinX1细胞中PinXl mRNA和蛋白表达水平较pCDNA3.1组、空白细胞组显著升高(P<0.05)。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低(P<0.05)。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数(PI)表达呈正相关性(rs=0.451,P=0.000)。结论：针对hTERT的反义寡核苷酸能诱导食管癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒酶合成端粒,从而抑制食管癌细胞的生长,说明端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长,为抗端粒酶的肿瘤基因治疗提供了实验基础。Eca109细胞转染PinX1基因后,外源PinX1基因可显著下调食管癌细胞中端粒酶活性及其hTERTmRNA表达,抑制肿瘤细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡。表明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。