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第一部分D-半乳糖建立L929细胞衰老模型目的:探讨D-半乳糖诱导L929细胞衰老的最适浓度,建立L929细胞衰老模型。方法:使用不同浓度D-半乳糖(0、5、10、20、40g/L)作用L929细胞,将L929细胞做如下分组:空白对照组(1640完全培养基),低浓度组(5 g/L D-半乳糖)、中浓度组(10g/L D-半乳糖)、高浓度组(20g/L D-半乳糖)、极高高浓度组(40g/L D-半乳糖)。用MTT法检测L929细胞活力,β-半乳糖苷酶染色法检测L929细胞β-半乳糖苷酶活性,线粒体膜电位检测法检测L929细胞凋亡。结果:相对于空白对照组,D-半乳糖组处理组的L929细胞活力明显降低,且细胞活力随着D-半乳糖浓度的升高而逐渐降低(P<0.01),相对空白对照组,D-半乳糖处理组细胞内β-半乳糖苷酶活性增高,细胞蓝染数量较空白对照组明显增多(P<0.01),当细胞超过20g/L时,细胞蓝染数量无明显升高(P=0.22)。与空白对照组比较,经过D-半乳糖处理后细胞内线粒体膜电位显著降低(P<0.05),且具有浓度依赖性,当D-半乳糖浓度超过20g/L时,细胞线粒体膜电位降低明显(P<0.01)。结论:D-半乳糖具有诱导细胞衰老的作用,当其浓度超过20g/L时,可致L929细胞出现明显凋亡现象。第二部分欧亚旋覆花总黄酮延缓L929细胞衰老的作用目的:探讨欧亚旋覆花总黄酮(Inula Britannica flower total flavonoids,IBFTF)对衰老L929细胞的作用。方法:使用不同浓度IBFTF作用于20g/L D-半乳糖诱导的衰老L929细胞,将实验分组为:空白对照组(1640完全培养基),模型组(20g/L D-半乳糖),IBFTF低浓度组(20g/L D-半乳糖+25mg/L IBFTF),IBFTF中浓度组(20g/L D-半乳糖+50mg/L IBFTF),IBFTF高浓度组(20g/L D-半乳糖+100mg/L IBFTF)。L929细胞培养完成后,MTT法检测细胞活力,检测细胞内SOD、ROS含量,免疫荧光检测细胞内P53蛋白的表达,鉴定细胞衰老水平。结果:相对空白对照组,模型组细胞的细胞活力显著降低(P<0.05),相对模型组,IBFTF处理的细胞细胞活力升高,当IBFTF浓度超过100mg/L后,细胞活力开始下降(P<0.05)。相对于空白对照组,模型组细胞内ROS含量显著升高(P<0.01),P53蛋白表达显著增多(P<0.01),细胞内SOD含量显著降低(P<0.01);相对于模型组,IBFTF处理的细胞内ROS含量显著降低(P<0.01),P53蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞内SOD含量显著升高(P<0.01),并具有浓度依赖性,当IBFTF浓度为100mg/L时,细胞内ROS含量(P<0.01),P53表达水平最低(P<0.05),SOD含量最高(P<0.01)。结论:IBFTF具有延缓L929细胞衰老的作用,且具有浓度依赖性,随着IBFTF浓度的升高,其抗衰老作用更明显,当IBFTF浓度为100mg/L时,IBFTF延缓细胞衰老的作用最强。第三部分欧亚旋覆花总黄酮对L929细胞自噬的影响目的:探讨IBFTF对L929细胞内细胞自噬的影响方法:使用梯度浓度IBFTF作用于衰老L929细胞24h后,将实验分组为:空白对照组(1640完全培养基),模型组(20g/L D-半乳糖),IBFTF低浓度组(20g/L D-半乳糖+25mg/L IBFTF),IBFTF中浓度组(20g/L D-半乳糖+50 mg/L IBFTF),IBFTF高浓度组(20g/L D-半乳糖+100mg/L IBFTF)。用Western Blot检测细胞内Beclin 1、P62、LC3蛋白表达,OA染色检测细胞内溶酶体浓度。结果:与空白对照组相比较,经过D-半乳糖处理的L929细胞胞内LC3、Beclin1蛋白表达明显降低(P<0.01),细胞内P62蛋白表达明显升高(P<0.01),细胞内溶酶体数量降低(P<0.01);相对于模型组,经过IBFTF处理后,L929细胞内LC3、Beclin1蛋白表达明显升高(P<0.01),P62蛋白表达明显降低(P<0.01),溶酶体数量升高(P<0.05),且这个过程具有浓度依赖性,当IBFTF浓度为100mg/L时,细胞内LC3、Beclin1、P62蛋白表达水平及细胞内溶酶体数量最高(P<0.01)。结论:IBFTF能促进细胞内自噬蛋白的表达,诱导衰老L929细胞自噬水平的提高。第四部分欧亚旋覆花总黄酮延缓L929细胞衰老与细胞自噬的关系目的:探讨IBFTF延缓L929细胞衰老过程中对自噬水平的影响方法:分别使用1640培养基、20g/L D-半乳糖、100μg/L自噬抑制剂氯喹、100mg/L IBFTF、40ng/L自噬诱导剂雷帕霉素对衰老L929细胞作用24h,将细胞分组为:空白对照组(control组),模型组(20g/L D-半乳糖),阴性对照组(20g/L D-半乳糖+100μg/L氯喹)IBFTF组(20g/L D-半乳糖+100mg/L IBFTF),阳性对照组(20g/L D-半乳糖+40ng/L雷帕霉素)。使用免疫组化法检测细胞LC3蛋白的表达,通过Western-Blot检测细胞内P16、P19、P21、P53、LC3、Beclin1P62蛋白的表达。结果:经过D-半乳糖处理的L929细胞相对空白对照组细胞P19、P16、P21、P53、P62蛋白的表达升高,差异有统计学意义(P<0.01),其中模型组和阴性对照组细胞内LC3、Beclin1表达降低明显(P<0.01);IBFTF处理组和阳性对照组细胞内LC3、Beclin1相对于模型组和阴性对照组明显升高,而细胞内P19、P16、P21、P53、P62蛋白相对模型组和阴性对照组含量明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论:IBFTF延缓L929细胞衰老的过程中伴随着细胞自噬水平的改变,IBFTF延缓细胞衰老可能与细胞内自噬水平的升高有关。