灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是一种重要的植物病原真菌,同时也是研究植物与微生物互作的重要模式生物之一,从分子生物学的角度去分析研究该真菌关键基因的功能,可以加速对灰葡萄孢菌生物学及其致病分子机制的认识,从而为灰霉病防治技术的进一步发展提供新的理论基础。本实验根据根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的T-DNA插入技术对灰葡萄孢菌进行了遗传转化,结果表明本实验的转化效率为每106个灰葡萄孢菌分生孢子可得到约75个抗潮霉素菌株,最后总共得到了 320多个转化子,对这些转化子进行了番茄叶片侵染实验,筛选出了几个致病力明显减弱的转化子,这些转化子编号为10、68、121、136、137。这些转化子通过PCR扩增潮霉素基因初步鉴定均有T-DNA插入。利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术扩增了这些转化子的T-DNA插入位点的旁侧序列,并与灰葡萄孢菌数据库进行比对,结果显示T-DNA插入的基因大部分为未知功能的预测基因,其中10号转化子的目的基因编码一种与多蛋白桥梁因子相似的蛋白。以T-DNA旁侧序列设计引物来验证这些转化子的单异核情况,结果表明大部分的转化子均为异核体,因此在灰葡萄孢菌中,异核现象是一种普遍的现象,最后对这些异核体进行了单孢分离实验,分离出了 7号转化子、136号转化子的单核体菌株。本研究通过潮霉素基因作为探针进行Southern杂交验证,由于136号菌株在生长表型与致病性上均比较特殊,因此通过Southern杂交来验证其拷贝数,由于DNA浓度比较低,136号转化子条带比较模糊。最后实验通过RT-PCR检测基因表达情况,确认136号转化子被T-DNA插入的基因已失活。79号转化子中T-DNA插入的基因编码的蛋白与真菌蛋白磷酸酶2A调控B 亚基(protein phosphatase 2A regulatory B subunit)比较相似,79突变体表型为生长速率减慢、产孢能力降低、菌丝较稀疏、对番茄叶片的致病能力减弱。通过PCR实验克隆出该完整基因,再经过LR反应,完成表达载体的构建,最后构建到根癌农杆菌的T-DNA中,重新转化79号转化子,以实现基因的互补,从而分析该基因的功能。由实验结果可知,79号转化子在含有终浓度为8000μg/mL荧光增白剂的PDA平板上敏感,而野生型和互补转化子的菌落明显比79号转化子大,由此可以初步判断该基因与几丁质合酶相关,最后由荧光定量PCR结果再次验证了该结果。而在0.8mg/mL斑蝥素的药物平板上生长时,野生型菌株与79号转化子区别不明显,该结果可能与79号转化子为异核体有关。7号转化子其表型为:生长速率与野生型相比明显下降、菌丝稀疏、菌落颜色比较淡,致病力明显降低等。由于该转化子被插入的基因功能未曾报道过,其功能未知,则实验中只能通过设计一系列的药物敏感实验来研究该基因功能。由实验结果可知突变体7号在高渗透压药物平板上的表型与野生型基本上一致,但是该基因的失活造成突变株的感染能力明显下降,并且生长速率也明显变慢,且造成突变株细胞壁中的几丁质含量增加,这一点从几丁质含量的测定实验中可以得到验证,荧光定量PCR的实验结果也说明了这点。由这些实验结果推测7号转化子目的基因的功能与灰葡萄孢菌的生长发育、致病性相关,且与几丁质合酶Ⅲ存在一定的关联性。