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随着我国经济的发展和人民生活水平的提高,饮食结构和环境的改变,心脑血管疾病呈上升趋势。各种代谢性疾病,特别是肥胖、糖尿病及其代谢综合症所致的心脑血管疾病的比例也越来越高,以血管并发症为主的糖尿病并发症所造成的后果将成为家庭与社会的沉重负担。血管重构也是糖尿病血管并发症发生的重要病理基础,深入探讨其发病机制有助认识和解决糖尿病血管并发症,寻找疾病早期诊断和疾病专柜的预警标志,为治疗提供新的思路。组织重构实际上是一个组织损伤修复的过程,,当修复过程失调或过度时,这些反应可以导致组织纤维化,其特征是病理的成纤维细胞和肌成纤维细胞的积聚和细胞外基质合成过度。血管重构的特征之一是血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移,使动脉壁中层组织明显增厚,管腔狭窄,甚至导致动脉硬化。近年来,1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)在血管重构发生中的作用正逐渐被人们认识。S1P是一种存在于血浆中的多效信号脂质分子,主要来源于细胞膜鞘磷脂的分解和代谢。S1P是一种重要的平衡性物质,大多数情况下S1P即可在细胞内作为第二信使传递信号,也可作为第一信使和细胞膜上相应受体相互结合,参与包括细胞分化、迁移、存活、增殖、血管生成、免疫以及过敏反应等生物学作用。已有研究证实,S1P在组织损伤后的伤口愈合和纤维化反应中起重要作用。S1P通过其受体信号,调节血管通透性,调节上皮细胞凋亡、成纤维细胞迁移和肌成纤维细胞的分化。已有研究证明糖尿病的动物模型和患者血清均有S1P含量的增加,提示S1P可能参与糖尿病及其并发症的发生和发展。糖尿病代谢障碍引起的高糖、高脂和糖基化终产物的堆积是否通过S1P及其受体影响血管平滑肌细胞的增殖和迁移,从而介导血管重构等目前还未见报道。研究目的:本研究将在证明晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可以导致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖迁移的前提下,探讨不同 S1P 受体(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR),特别是 S1PR1和S1PR2在其中的作用和机制。方法:实验的研究对象为人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs)。AGE 修饰的白蛋白(AGE-modified bovine serum albumin,AGE-BSA)由牛血清白蛋白与D-葡萄糖共同孵育8周并过滤而获得。采用CCK-8实验检测平滑肌细胞增殖能力,采用细胞划痕实验及Transwell实验检测内皮细胞的迁移能力;采用western blot技术检测S1P不同受体蛋白表达水平的变化,选用抑制剂或激动剂影响S1PR1和S1PR2的功能。本研究所有数值均用平均值±标准差表示,使用SPSS13.0软件进行数据分析,统计方法采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)后进行 Post Hoc 检验(方差齐性是采用LSD法,方差不齐时采用Dunnet’sT3方法),以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.BSA和AGE-BSA促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移。(1)BSA和AGE-BSA促进血管平滑肌细胞的增殖CCK-8实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=5.434,P=0.045)。与Control组相比,BSA组OD值明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),与Control组相比,AGE-BSA组的增殖也明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),AGE-BSA组与BSA组相比,其促增殖作用更加明显,具有统计学意义(P<0.05)。这一结果说明,BSA对平滑肌细胞的增殖具有促进作用,这一实验结果符合内皮细胞损伤后血清暴露导致平滑肌细胞过度增殖和动脉硬化的临床和实验现象,AGE-BSA对平滑肌细胞的增殖促进作用更加明显。(2)BSA和AGE-BSA促进血管平滑肌细胞的迁移划痕实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=16.35,P=0.006)。与Control组相比,BSA组的划痕恢复百分比明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),与Control组相比,AGE组的划痕恢复百分比也明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),AGE-BSA组与BSA组相比,其加快迁移的作用更加明显,具有统计学意义(P<0.05)。Transwell的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=225.2,P=0.0001)。与Control组相比,BSA组的迁移细胞数量明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),与Control组相比,AGE组的迁移细胞数量也明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),AGE-BSA组与BSA组相比,其加快迁移的作用更加明显,具有统计学意义(P<0.05)。这些结果说明,BSA本身就具有促进血管平滑肌细胞迁移的作用,符合内皮细胞损伤后血清暴露导致平滑肌细胞过度增殖迁移的临床和实验现象,AGE-BSA的作用则更加明显。2.S1PR1活性对BSA和AGE-BSA介导的平滑肌细胞增殖与迁移的影响(1)S1PR1抑制剂VPC抑制平滑肌细胞的增殖和迁移用S1PR1的拮抗剂VPC预处理细胞,再给予BSA或AGE-BSA刺激。CCK-8的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=20.75,P=0.004)。与BSA组相比,VPC+BSA组的OD值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,VPC+AGE-BSA组的OD值也明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。而与CTRL组相比,VPC本身也可以明显抑制平滑肌细胞的增殖。这一结果显示,抑制S1PR1的活性可以预防BSA和AGE-BSA引起的平滑肌细胞过度增殖,提示S1PR1的激活参与介导了 BSA和AGE-BSA的促增殖的作用。划痕实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=12.55,P=0.002)。与BSA组相比,VPC+BSA组的划痕恢复百分比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,VPC+AGE-BSA组的划痕恢复百分比也明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);而与CTRL组相比,VPC本身也可以明显抑制平滑肌细胞的迁移。这一结果说明,S1PR1的抑制剂VPC可以抑制BSA和AGE-BSA引起的平滑肌细胞迁移能力增强,提示S1PR1的激活参与介导这一促迁移作用;Transwell迁移实验结果与划痕实验结果类似。这些结果说明,S1PR1的抑制剂VPC可以抑制BSA和AGE-BSA引起的平滑肌细胞迁移能力增强,提示S1PR1的激活参与介导这一促迁移作用。(2)S1PR1激动剂SEW促进平滑肌细胞的增殖和迁移用S1PR1的激动剂SEW预处理细胞,再给予BSA或AGE-BSA刺激。CCK-8的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=4.388,P=0.0419)。与BSA组相比,SEW+BSA组的OD值明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,SEW+AGE-BSA组的OD值上升幅度不明显,差异不具有统计学意义。这一结果说明,S1PR1激动剂的加入对BSA引起的平滑肌细胞迁移有促进作用,而对AGE-BSA引起的平滑肌细胞增殖影响不大,或者说仅有轻度增加,也进一步反证了 AGE-BSAT通过激活S1PR1介导平滑肌细胞的增殖,AGE-BSA作用已经充分激活了 S1PR1,再加入S1PR1的激动剂效果不明显。划痕实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=12.22,P=0.002)与BSA组相比,SEW+BSA组的划痕恢复百分比明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05);与AGE+BSA组相比,SEW+AGE-BSA组的划痕恢复百分比上升幅度不明显,差异不具有统计学意义。Transwell实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=19.31,P=0.0001)。与BSA组相比,SEW+BSA组的迁移细胞数量明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05);与AGE+BSA组相比,SEW+AGE-BSA组的迁移细胞数量上升幅度不明显,差异不具有统计学意义。这些结果说明,S1PR1激动剂的加入对BSA引起的平滑肌细胞迁移有促进作用,而对AGE-BSA引起的平滑肌细胞迁移影响不大,提示AGE-BSA作用已经充分激活了 S1PR1,再加入S1PR1的激动剂效果不明显。3.S1PR2活性对BSA和AGE-BSA介导的平滑肌细胞增殖与迁移的影响用S1PR2的拮抗剂JTE预处理细胞,再给予BSA或AGE-BSA刺激。CCK-8的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=19.62,P=0.0005)。与BSA组相比,JTE+BSA组的OD值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,JTE+AGE-BSA组的OD值也明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。这一结果说明,S1PR2抑制剂的加入对BSA与AGE-BSA引起的平滑肌细胞增殖有抑制作用,这都说明S1PR2的激活促进平滑肌细胞的增殖。划痕实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=10.35,P=0.004)。与BSA组相比,JTE+BSA组的划痕恢复百分比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,JTE+AGE-BSA组的划痕恢复百分比下降幅度不明显,差异不具有统计学意义。JTE组与CTRL组相比,下降幅度具有统计学差异(P<0.05)。Transwell实验的结果显示,不同组之间均有显著性差异(F=257.9,P=0.0001)。与BSA组相比,JTE+BSA组的迁移细胞数量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),与AGE+BSA组相比,JTE+AGE-BSA组的迁移细胞数量下降幅度显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。JTE组与CTRL组相比,下降幅度具有统计学差异(P<0.05)。这些结果说明,S1PR2抑制剂的加入对BSA引起的平滑肌细胞迁移有抑制作用,而对AGE-BSA引起的平滑肌细胞迁移也有明显影响,抑制剂JTE本身能抑制平滑肌细胞的迁移。这说明S1PR2可以促进平滑肌细胞的迁移。4.AGE-BSA不影响平滑肌细胞S1PR1和S1PR2的蛋白表达(1)不同浓度的AGE-BSA刺激不影响平滑肌细胞S1PR1/2的表达用不同浓度AGE-BSA(12.5、25、50、100 μg/ml)分别刺激血管平滑肌细胞24h,以BSA(100μg/ml)作为对照,使用Western Blot的方法,检测S1PR1和S1PR2的表达,结果显示,不同组之间不具有显著性差异,各组与Control组相比并无统计学意义,这一结果表明S1PR1/2的蛋白表达并没有随着AGE-BSA浓度的递增而发生改变。不同浓度的AGE-BSA并不影响血管平滑细胞S1PR1/2的表达。(2)不同时间的AGE-BSA刺激不影响平滑肌细胞S1PR1/2的表达将同一浓度的AGE-BSA(100μg/ml)分别刺激血管平滑肌细胞(12、24、48、72h),以BSA(100μg/ml刺激24h)作为对照,使用Western Blot的方法,检测S1PR1和S1PR2的表达,结果显示,不同组之间不具有显著性差异,各组与Control组相比并无统计学意义,这一结果表明S1PR1/2的蛋白表达并没有随着AGE-BSA刺激时间的延长而发生改变。上述结果提示BSA和AGE-BSA的刺激并不影响血管平滑肌细胞S1PR1和S1PR2的表达水平。以上实验结果证明,BSA本身具有促进血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用,符合血管内皮细胞损伤后血清暴露导致平滑肌细胞过度增殖迁移的临床和实验现象;AGE-BSA对平滑肌细胞的增殖和迁移有更加明显的促进作用。S1PR1的抑制剂VPC分别抑制了 BSA和AGE-BSA引起的平滑肌细胞增殖与迁移能力增强,S1PR1的激动剂SEW可以进一步促进BSA引起的平滑肌细胞增殖迁移增强,但对AGE-BSA引起的促增殖迁移效应影响不大。上述结果提示S1PR1的激活参与介导了 BSA和AGE-BSA这一促平滑肌细胞增殖与迁移的作用,而AGE-BSA有更强烈的激活S1PR1的作用;S1PR2抑制剂的加入也能明显抑制BSA引起的平滑肌细胞增殖与迁移,对AGE-BSA引起的平滑肌细胞增殖与迁移也有一定的抑制作用,这说明BSA和AGE-BSA也可以通过激活S1PR2促进平滑肌细胞的增殖;而BSA和AGE-BSA刺激并没有引起S1PR1和S1PR2表达的变化。结论:1.BSA以及AGE-BSA均能促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移,而AGE-BSA有更明显的促进平滑肌细胞增殖迁移的作用;2.S1PR1和S1PR2的激活均可介导BSA和AGE-BSA对平滑肌细胞的促增殖迁移作用,而AGE-BSA对两种受体激活的程度可能更明显;3.BSA以及AGE-BSA不影响血管平滑肌细胞S1PR1和S1PR2的表达。