对机体内外机械刺激的感知和应答是生命体的重要能力,对于物种的生存和延续至关重要。从细菌分裂,植物生长,到体液平衡和血压的调控,触觉、听觉、平衡等感觉的产生,机械响应涉及众多的生理过程。而机械敏感性离子通道作为一类特殊的膜蛋白,通过通道分子构象的变化将机械刺激转化为化学信号或生物电信号,在机械响应中起着重要作用。对机械敏感性离子通道的结构、功能及其开放机制的研究有助于阐明生命活动中机械信号的传导过程。相对于高等生物中的机械敏感性离子通道,原核生物机械敏感性离子通道由于结构简单,功能明确,可以作为很好的研究模型。其中,大肠杆菌机械敏感性离子通道 Mechanosensitive channel of Small conductance(MscS)是一个很好的研究对象。MscS作为细胞的“紧急释放阀门”,能够在细菌周围环境渗透压急剧降低导致细菌体积膨胀时打开通道并释放内容物,平衡内外渗透压,防止细菌过度膨胀而破裂死亡。研究表明膜张力可以直接打开MscS,并形成～1nS电导的通道孔径。X衍射晶体结构数据显示大肠杆菌MscS是同源七聚体,每个亚基由286个氨基酸组成,包括三个跨膜区域(TM1,TM2和TM3)以及一个大的胞质区域。TM3形成孔道区域,胞质区涉及对通道电导,离子选择性等多种调节。有报导在机械刺激激活MscS通道开放时,TM3和胞质区均发生构象变化。然而两者之间是否有明确的相互作用,胞质区是否可以通过对TM3区域的作用调节MscS通道的功能还不清楚。我们推测这两个重要结构域并不是孤立的,而是存在着相互作用,彼此配合,共同调节通道的开放。根据MscS晶体学结构,TM3bα螺旋位于细胞膜和细胞质的交界处,在跨膜结构域和胞质结构域之间起着桥梁的作用。在胞质结构域,小a螺旋Cyto-helix在空间结构上与TM3b靠近,并且高度保守。通过微生物生理检测、单通道电生理记录、半胱氨酸交联、脂质体重组荧光分析等方法,我们对TM3b和Cyto-helix之间的相互作用及其对MscS开放的调节进行了研究。考虑到MscS没有内源性的半胱氨酸,我们首先构建TM3b和Cyto-helix半胱氨酸单突变文库,检测半胱氨酸交联、巯基试剂结合等对通道功能的影响。通过突变筛选,我们发现TM3b helix上的117位天冬酰胺(N117)与Cyto-helix上的167位天冬酰胺(N167)均突变成半胱氨酸后,表达N117CN167C双突变MscS的细菌在低渗刺激下成活率比野生型显著降低;电生理表明N117CN167C双突变MscS通道活性丧失;WesternBlot显示N117C与N167C之间形成明显二硫键,表现为多聚体形式。因此我们推测在通道开放过程中N117C与N167C可以相互接近并发生作用,之间形成的二硫键是导致通道失活的原因。进一步我们利用重金属离子螯合组氨酸的方法。金属离子螯合组氨酸起到类似于二硫键交联的作用。结果表明组氨酸双突变N117HN167H MscS在Zn2+处理后,可以发生螯合,并导致通道活性显著降低。正负电荷相互吸引的方法也验证了我们的结论。N117R带有正电荷,N167E带有负电荷。我们发现N117RN167E MscS电导显著降低,说明两个异性电荷相互吸引使得通道难以开放。最后,结合GOF(gain-of-function)突变体的方法也证明N117和N167的相互作用可以改变通道的功能。L109S MscS是非常强烈的GOF突变体,在无机械刺激条件下,通道能够自发开放。结果显示L109SN117CN167C MscS电导比L109S MscS电导显著降低,说明N117CN167C的存在使得通道不能完全开放;而且氧化剂交联半胱氨酸后导致L109SN117CN167CMscS的通道活性几乎丧失,这也与前面的结果一致。我们的研究表明在通道开放过程中,N117与N167两个氨基酸会相互靠近并相互作用。如果两者发生交联,MscS通道的活性会被抑制。根据以上结果,我们提出了一种MscS开放过程中的构象偶联模型,显示TM3b和Cyto-helix会相互接近然后分离,这为MscS开放机制的深入研究提供了基础。