论文部分内容阅读
目的:当牙周组织发生炎症致牙周组织的微循环障碍时,牙周组织乏氧明显,正畸治疗过程中,牙齿受力侧有局部缺血现象可以导致牙周组织乏氧。组织乏氧以及炎症过程中一些炎症细胞因子都可以活化乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α);另一方面HIF-1α最主要的靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)不仅可以促进血管的生成并且在骨组织的重塑方面也起着重要作用。乏氧环境对组织有着重要的生物学影响,因此本实验旨在乏氧环境下培养牙周膜细胞,模拟相当于牙周膜组织局部缺血的病理模型。探讨乏氧对牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,ALP)的影响,并检测牙周膜细胞在乏氧环境下HIF-1α及VEGF的表达情况。研究乏氧对牙周膜细胞的生物学特性的影响,为进一步研究乏氧对牙周病理变化及组织再生奠定理论基础。方法:牙周膜细胞取自因正畸需要而拔出的健康前磨牙,取根中1/3牙周膜组织,常规DMEM法培养。细胞增殖达汇合点后细胞传代,第3代细胞用于实验。1.实验分组常氧组(对照组):牙周膜细胞分两组在20%O2、5%CO2、75%N2的37℃培养箱中分别培养24h和48h;乏氧组:牙周膜细胞分两组在1%O2、5%CO2、94%N2的37℃培养箱中分别培养24h和48h。2.将牙周膜细胞以2×104个/ml接种于96孔板中,按上述实验分组移入常氧与乏氧培养箱中培养,用MTT法测牙周膜细胞的增殖活性,用PNPP法测牙周膜细胞的ALP活性。3.将牙周膜细胞以1×106个/ml接种于6孔板中,按上述实验分组移入培养箱中培养,Trizol两步法分别提取细胞总RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达情况。4.将牙周膜细胞以2×104个/ml接种于置有盖玻片的6孔板中,按实验分组移入培养箱中培养,免疫组化技术检测HIF-1α与VEGF的表达情况。结果:1.所有组别的细胞增殖率随培养时间呈依赖性的增高。乏氧24h与对照组相比增殖较大,但缺乏统计学差异。乏氧组乏氧48h与对照组相比增殖活性增高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.所有组别细胞的ALP活性随培养时间而降低,但乏氧24h和48h与对照组相比ALP活性明显降低,差别具有统计学意义(p<0.05)。3.乏氧组牙周膜细胞HIF-1αmRNA的表达与对照组无统计学意义的差别。乏氧24h与48h牙周膜细胞VEGF mRNA的表达明显高于对照组(p<0.05)。4.细胞爬片免疫组织化学染色结果显示:乏氧24h与48h的牙周膜细胞HIF-1α表达呈阳性反应,乏氧24h大量HIF-1α蛋白在胞核积聚,乏氧48h阳性染色颗粒在胞质与胞核中沉积,而常氧环境下培养的细胞无观察到HIF-1α蛋白的表达(p<0.01)。VEGF的表达呈时间依赖性增加,常氧48h后VEGF呈微弱阳性表达,乏氧组24h与48h VEGF的染色明显强于对照组(p<0.01)。结论:乏氧使牙周膜细胞增殖能力提高,ALP活性降低,HIF-1α与VEGF表达增加。虽然在乏氧环境中牙周膜细胞有一定程度的代偿增殖作用,但是乏氧却不利于牙周膜细胞的成骨活性,可以加速牙周炎的发生与发展,提示临床牙周炎及正畸所导致的乏氧环境对牙周膜细胞活性与功能有一定的影响。