十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）是一种非侵入性原生动物寄生虫,它能感染人和多种哺乳动物并引起宿主腹痛、腹泻和吸收不良等症状。自噬是一种细胞分解代谢过程,负责消化细胞质内受损的细胞器、蛋白质和脂质,然后通过溶酶体将它们清除。这一过程对细胞生存和病原感染至关重要。已有研究证明自噬参与调控了寄生虫对宿主细胞紧密连接蛋白的破坏,以及自噬参与调控了细胞中与寄生虫感染密切相关的一氧化氮（nitric oxide,NO）的生成。目前贾第虫能否诱导宿主细胞自噬还是未知的。本研究通过建立贾第虫与肠上皮细胞互作模型,旨在探究贾第虫能否诱导肠上皮细胞自噬,以及自噬对贾第虫病相关的紧密连接蛋白表达和NO生成的影响,为研究贾第虫致病机制提供新的理论基础。在贾第虫与肠上皮细胞互作后,通过实时荧光定量PCR（q PCR）和Western blot检测了一些自噬相关基因的表达水平,随着贾第虫刺激时间增加,LC3、Beclin1和ULK1等自噬相关基因的转录和蛋白表达水平逐渐增加。免疫荧光实验也表明细胞内LC3蛋白的显著增多,Western blot结果显示p62蛋白也有显著下调。以上结果表明了贾第虫刺激后肠上皮细胞中自噬小体的生成增多。通过Western blot和免疫荧光实验检测了自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）对贾第虫诱导的LC3和p62的表达有显著影响,说明了贾第虫能诱导肠上皮细胞自噬。接下来探究了诱导细胞自噬的途径。通过Western blot实验检测了贾第虫刺激后细胞中几种自噬通路蛋白的表达,结果显示了贾第虫是通过AMPK/m TOR通路诱导肠上皮细胞的自噬。通过荧光探针DCFHDA标记的方法检测细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生,结果显示贾第虫刺激后肠上皮细胞ROS大量积累。通过q PCR、免疫荧光和Western blot检测了ROS抑制剂Nacetylcysteine（NAC）对细胞自噬以及AMPK/m TOR通路的影响,结果说明了贾第虫可以通过ROS-AMPK/m TOR途径诱导肠上皮细胞自噬。已有研究显示病原诱导的自噬参与下调紧密连接蛋白的表达,而贾第虫的致病机制之一就是通过破坏紧密连接蛋白来破坏肠道屏障。本实验检测了细胞紧密连接蛋白:Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的表达,Western blot结果表明随着贾第虫刺激时间增加这四种紧密连接蛋白表达逐渐降低。为了明确贾第虫通过ROSAMPK/m TOR诱导的自噬对紧密连接蛋白的影响,本实验使用了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）、CQ、m TOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）和NAC分别预处理了肠上皮细胞,q PCR和WB实验结果都表明了贾第虫通过ROS-AMPK/m TOR途径诱导的自噬参与了肠上皮细胞紧密连接的破坏。有大量文献研究了自噬与NO释放的关系,而贾第虫能使肠上皮细胞NO释放减少,以逃避宿主的免疫反应,所以本实验探究了贾第虫诱导的自噬是否与肠上皮细胞NO生成的减少有关。3-MA能有效缓解贾第虫诱导的肠上皮细胞NO释放的减少。而Rapa和NAC则显著降低和上调了NO的生成。这些结果说明了贾第虫通过ROSAMPK/m TOR诱导的自噬参与了肠上皮细胞NO生成减少的机制。此外,有大量文献证明了自噬对ROS的调节,所以本实验使用3-MA和CQ检验了贾第虫诱导的肠上皮自噬与细胞内ROS的关系,结果显示3-MA和CQ都能导致ROS的进一步积累增加,说明了贾第虫通过ROS诱导的自噬也能反过来调节ROS的生成。综上所述,本研究首次证明了贾第虫能通过ROS-AMPK/m TOR途径诱导肠上皮细胞自噬,且贾第虫能通过ROS-AMPK/m TOR自噬途径减少肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达和NO的生成,这可能为贾第虫的定殖和持续感染提供了有利条件。因此,本研究从贾第虫诱导肠上皮细胞的自噬参与了贾第虫的致病机制的角度来看,能进一步揭示贾第虫潜在的致病机制,为未来临床研究贾第虫病提供新的参考。