【摘 要】
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本试验根据GeneBank上发表的堆型艾美尔球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分LDH基因,大小为993bp。构建LDH的原核
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本试验根据GeneBank上发表的堆型艾美尔球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分LDH基因,大小为993bp。构建LDH的原核表达质粒,表达为42kDa的LDH重组蛋白,切胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔抗LDH多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光试验证明制备的多克隆抗体具有良好的反应性。利用一段编码(G4S)3多肽的碱基linker序列将LDH与ChIL-18基因进行连接,成功构建了一个融合基因真核表达载体质粒,即PVAX-IL-18-linker-LDH质粒。融合基因质粒的体外瞬时转染试验表明表达的融合蛋白可以被LDH多克隆抗体和ChIL-18多克隆抗体检测出来,证明融合基因表达的蛋白保留了所融合两段基因各自的生物学活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。动物免疫保护试验分5个处理组,即B组(不免疫不攻虫组)、H组(不免疫攻虫组)P组(PVAX免疫组)、L组(PVAX-LDH免疫组)、LK组(PVAX-IL-18-linker-LDH疫苗免疫组)。各组雏鸡在21和28日龄进行相应的处理,35日龄时以5×104孢子化卵囊进行攻虫处理。实验过程中在雏鸡21、28、35、42、49日龄时采取相应病料进行检测。结果表明,从28日龄开始两个免疫组雏鸡T淋巴细胞增殖功能就高于对照组,在42日龄免疫组极显著高于对照组,其中以免疫增强型DNA疫苗组稍好。B淋巴细胞增殖功能和LDH蛋白刺激淋巴细胞增殖功能检测结果与T淋巴细胞结果类似。免疫及攻虫后对各实验组免疫雏鸡的相对增重率、粪便卵囊排出数量、十二指肠病变记分及不同免疫组的免疫保护效率进行了比较。结果显示,各疫苗免疫组平均增重与对照组差异不显著,说明DNA疫苗免疫对增重无不良影响;疫苗攻虫组平均增重显著高于H组和P组,说明两组DNA疫苗对鸡抗球虫感染有很好的保护作用：L组和LK组卵囊排出量分别减少54.11%和60.44%,当有IL-18因子参加联合免疫时,效果更加明显。在抗球虫综合指数方面,疫苗组优于H组和P组,L组的ACI为176,LK组的ACI最高达到了179,表明有细胞因子协同后融合基因的免疫保护效果更明显。综上所述,ChIL-18基因可以提高LDH基因真核表达质粒刺激机体产生细胞免疫应答,进而提高机体抵抗球虫攻击的能力。本试验为进一步研究LDH的生物学活性提供了试验依据,同时为探讨开发研制新型免疫增强型抗球虫核酸疫苗提供了理论基础。
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