消去化修饰（Eliminylation）一般指通过β-消去反应,不可逆消去丝氨酸、苏氨酸的羟基或半胱氨酸的巯基而生成不饱和氨基酸。而磷酸苏氨酸裂合酶介导的消去化修饰则是不可逆“去磷酸化”p-MAPKs,使p-MAPKs永久消去一分子磷酸。区别于去磷酸化修饰,介导消去化修饰的磷酸苏氨酸裂合酶作用于磷酸基团Cα-Cβ-OPγ中的Cβ-OPγ键并使之断裂,从而生成Cα=Cβ不饱和系统,而介导去磷酸化修饰的磷酸酶作用于P-O键并生成羟基,因此由磷酸苏氨酸裂合酶介导的消去化修饰是不可逆的。磷酸苏氨酸裂合酶是病原菌的效应蛋白,通过不可逆“去磷酸化”p-MAPKs而抑制宿主的免疫反应。目前还未在真核体系中鉴定到磷酸苏氨酸裂合酶的同源蛋白。那真核细胞中是否存在其他消去化修饰的蛋白呢?现由于缺乏可靠的鉴定消去化修饰蛋白的方法,使对消去化的认识很匮乏,目前仅鉴定到2类蛋白及200余种多肽发生了消去化修饰。巴豆酰修饰（Crotonylation）最早在组蛋白上被发现,主要分布在转录启动子和增强子上,有比乙酰化更强的转录激活作用。大量研究表明非组蛋白也发生了巴豆酰修饰,并广泛参与生命活动,这丰富了我们对巴豆酰修饰的认识。巴豆酰修饰区别于其他短链酰化修饰,在结构上,类似于消去化修饰,巴豆酰修饰同样含有不饱和双键,并且巴豆酰基团的不饱和双键介导了巴豆酰修饰蛋白与巴豆酰“阅读器”的相互作用。基于抗体富集质谱检测是常规翻译后修饰的鉴定方法,但本课题研究的消去化修饰并没有泛抗体可用,因此自2007年提出消去化修饰的概念,至今没有理想的鉴定方法。在本研究中我们着手于双键蛋白的特征结构,碳碳双键易与亲核试剂发生亲核加成,因此利用双键与巯基之间的Michael加成反应,开发了标记双键蛋白的特异性巯基探针。此外在巯基探针上衍生了生物素标签,在蛋白双键被标记后,可解决后续的检测和富集问题。无论是消去化修饰还是巴豆酰修饰皆含不饱和双键,因此本研究建立的鉴定方法填补了消去化修饰蛋白研究的空白,同时也为鉴定巴豆酰修饰蛋白提供了一种经济有效的补充方法。靶蛋白被标记后使之衍生了生物素标签,利用链霉亲和素与生物素的固有亲和力,可将标记靶蛋白固定在链霉亲和素beads上。但链霉亲和素与生物素之间的超强结合力在一般条件下认为是不可逆的,这成为下游研究的阻石。而本实验室改造的链霉亲和素突变体降低二者之间的缔合常数可实现弹性结合,达到生物素化配体温和洗脱的目的。针对以上论述,具体展开了以下研究:首先利用磷酸苏氨酸裂合酶介导消去化修饰的机制在体外进行生化反应得到消去化蛋白,分别纯化蛋白His-ERK、His-Adk-MEK1R4F、Osp F,Adk-MEK1R4F催化ERK发生磷酸化修饰,Osp F介导p-ERK消去一分子磷酸生成消去化ERK（Δ-ERK）,然后以Δ-ERK研究巯基探针对消去化蛋白的标记。但在实验过程中发现存在非特异性反应,一方面可能是探针合成时副产物带来的非特异性,另一方面是二硫键带来的非特异性反应,针对以上问题将探针预处理后可特异性标记双键蛋白;其次以组蛋白探究巯基探针对巴豆酰不饱和双键的标记;最后利用链霉亲和素系统纯化标记的Δ-ERK和组蛋白;根据以上建立的方法在裂解液中标记潜在的含双键蛋白。综上所述,我们基于迈克加成原理建立了一套标记双键蛋白的方法,特别是对现缺乏可靠鉴定方法的消去化修饰提供了合理策略,同时也是鉴定巴豆酰蛋白的补充方法。