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背景与目的血小板反应蛋白1(Thrombospondin-1,TSP-1)是一种基质细胞糖蛋白,最早发现于活化的血小板中。人体内巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等均能表达和分泌TSP-1,TSP-1可以通过抑制或增强多种细胞因子的分泌来调节组织炎症的发生。胸腺是供T细胞分化发育成熟的中枢免疫器官,包括胸腺上皮细胞(Thymic Epithelial Cell,TEC)和胸腺间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,tMSC)在内的胸腺基质细胞共同孵育发育中的胸腺细胞分化为成熟的T细胞,输出到外周;同时胸腺基质细胞也通过产生的各种细胞因子参与免疫调节。重症肌无力(Myasthenia Gravis,MG)是一种器官特异性慢性自身免疫性疾病,多数患者体内产生了针对自身乙酰胆碱受体(Acetylcholine Receptor,AChR)的抗体。以往研究发现,AChR+MG患者胸腺炎症感染等病变与MG发生机制密切相关,并且MG患者胸腺炎症是由促炎性细胞因子IL-6,IFN-γ,TNFα和IL-17的分泌驱动的。课题组前期通过基因芯片分析MG胸腺组织炎症相关因子的表达发现,除了趋化因子(CCL-2、CCL-3、CXCL-10等)、促炎症因子(IL-6、IFN-γ等)的表达异常,MG胸腺组织TSP-1的表达量上调了20倍,提示TSP-1可能对于MG胸腺炎症微环境的形成有关。本研究通过免疫组织化学染色显示,在胸腺组织中,TSP-1阳性细胞主要分布在胸腺髓质区与小叶间隙。为探讨TSP-1表达上调与胸腺炎症环境的关系,本研究通过干预胸腺间充质干细胞TSP-1的表达,分析外泌体转移MSC表达的TSP-1对巨噬细胞活化以及对CD4+T细胞分化的影响,为明确TSP-1参与组织炎症的方式提供实验依据。方法1.TSP-1在胸腺的表达及分布:收集MG相关患者胸腺和先心患儿正常胸腺标本,制备胸腺石蜡切片,TSP-1免疫组化染色,确定TSP-1在不同病理胸腺中的表达与分布。2.LPS对tMSC中TSP-1表达的影响:LPS刺激tMSC,qRT-PCR以及WB观察TSP-1的表达变化。3.TSP-1干扰慢病毒载体的制备和感染tMSC:构建TSP-1干扰载体质粒shRNA1、shRNA2,用293T细胞包装病毒。分别用sh1、sh2慢病毒感染tMSC细胞72h。qRT-PCR以及WB检测TSP-1的表达改变。4.tMSC分泌的的外泌体的提取与鉴定:利用外泌体分离试剂盒分别提取正常MSC、LPS刺激tMSC、TSP-1干扰慢病毒感染后培养上清中的外泌体,WB、流式细胞术检测外泌体表面标志:CD63、CD9、CD81、电子显微镜检测外泌体形态。流式细胞术检测外泌体中TSP-1表达。5.不同来源巨噬细胞的诱导及鉴定:购买THP1单核细胞系,PMA诱导使其分化为M0,已知INF-γ/LPS诱导M0分化为M1型促炎巨噬细胞,IL-4/IL-13诱导M0分化为M2型抑炎巨噬细胞。或者分离人PBMC,GM-CSF诱导巨噬细胞。加入外泌体共培养后观察巨噬细胞形态变化。6.TSP-1对巨噬细胞活化的影响:外泌体、细胞培养上清(CM)、去除外泌体的细胞培养上清分别与THP1来源的巨噬细胞共培养24h后、RT-PCR检测IL-6、IL-1 β、TNF-α的RNA表达。LPS预处理tMSC后获得的外泌体(以下记做MEXLPS)和LPS预处理tMSC后沉默TSP-1获得的外泌体(以下记做MEXLPS-TSP1sh)与THP-1来源巨噬细胞和人PBMC来源巨噬细胞共培养,RT-PCR和流式细胞术检测巨噬细胞分泌炎症因子的改变。7.TSP-1对CD4+T细胞分化与增殖的影响:免疫磁珠法分选人PBMC中CD4+T淋巴细胞,与MEXLPS、MEXLPS-TSP1sh共培养,通过流式细胞术检测细胞培养上清炎症因子的改变以及CD4+T细胞的分化与增殖情况。结果1.TSP-1在MG相关不同病例胸腺组织中的分布:免疫组化结果显示心先病患儿正常胸腺组织皮髓结构明显,TSP-1表达较少,主要分布在胸腺皮髓交界处,小叶间隙;非肿瘤MG患者胸腺组织明显变小,皮髓边界不清,细胞杂乱空泡较多,TSP1+细胞增高且散在分布。胸腺瘤不伴MG患者胸腺组织皮髓边界不清,TSP-1+细胞量不多且散在分布。MG伴胸腺瘤组织亦无法准确定位,但组织破坏更加严重,TSP-1+细胞分布无明显规律。2.LPS对tMSCs表达TSP-1的影响:通过用LPS对tMSC刺激24h、48h、72h后,WB结果显示随着刺激时间的增加,TSP-1的表达量增加且72h表达量最高(P<0.0001);qRT-PCR结果中TSP-1的表达也为相同趋势(P<0.05)。3.TSP-1干扰慢病毒的感染tMSC引起TSP-1表达降低:将制成的TSP-1干扰慢病毒sh1、sh2分别感染tMSC72h,WB结果显示sh1、sh2组TSP-1的表达量明显降低(P<0.01);qRT-PCR结果中TSP-1的表达也为相同趋势(P<0.001)。4.tMSC分泌的外泌体的提取与鉴定:WB结果显示提取的外泌体中CD63、CD9均有表达,流式结果显示CD63、CD81均有阳性表达。电子显微镜下外泌体为直径为40-120nm的双层膜状结构。TSP-1干扰慢病毒感染tMSC后分泌的外泌体中TSP-1的表达荧光强度降低。5.巨噬细胞的诱导培养与鉴定:PMA刺激THP1 24h后使其分化成M0,已知用诱导因子INF-γ/LPS诱导M0分化为M1型巨噬细胞,IL-4/IL-13诱导M0分化为M2型巨噬细胞。MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh与M0共培养 12h后用CD86、HLA-DR标记M1型巨噬细胞,用CD163、CD206标记M2型巨噬细胞,发现CD86、HLA-DR的表达升高(P<0.05),CD163、CD206的表达并没有明显差异(P>0.05)。6.TSP-1对THP1来源巨噬细胞活化的影响:MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与THP1来源的M0共培养12h后qRT-PCR的结果显示与对照相比,MEXLPS刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6(P<0.001)、IL-1β(P<0.001)、TNF-α(P<0.01)的RNA表达都有明显增高,IL-6(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)、MCP-1(P<0.01)、IL-18(P<0.05)的分泌都明显升高。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)的RNA表达都有明显减少,IL-6(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)、MCP-1(P<0.01)、IL-18(P<0.05)的分泌明显减少。7.TSP-1对人PBMC来源巨噬细胞活化的影响:MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与人PBMC来源的M0共培养12h后qRT-PCR的结果显示与对照相比,MEXLPS刺激M0后M1 型相关细胞因子IL-6(P<0.01)、IL-1 β(P<0.01)、TNF-α(P<0.01)的RNA表达都有明显增高,IL-6(P<0.001)、IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.0001)、IFN-γ(P<0.001)、IL-10(P<0.001)、IL-17a(P<0.01)、IL-18(P<0.01)、IL-23(P<0.01)、IL-33(P<0.01)的分泌都升高。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激M0后M1型相关细胞因子IL-6(P<0.01)IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.01)的RNA表达都有明显减少,IL-6(P<0.001)、IL-1 β(P<0.01)、TNF-α(P<0.0001)、IFN-γ(P<0.001)、IL-10(P<0.001)、IL-17a(P<0.01)、IL-18(P<0.01)、IL-23(P<0.05)、IL-33(P<0.05)的分泌都减少。8.TSP-1对CD4+T细胞分化与增殖的影响:与MEXLPS和MEXLPS-TSP1sh分别与活化的CD4+T细胞共培养12h后流式结果显示与对照相比,Th1、Th2、Th17、Treg细胞的比例无明显变化,T细胞增殖明显减少(P<0.05),细胞培养上清中IL-6(P=0.01)、TNF-α(P<0.001)明显增加。与MEXLPS刺激组相比,MEXLPS-TSP1sh刺激活化的CD4+T细胞12h后Th1(P<0.05)、Th17(P<0.05)细胞的比例明显减少,Treg(P<0.05)细胞的比例增加,Th2细胞的比例没有明显改变,T细胞增殖明显增加(P<0.05)。细胞培养上清中IL-6(P<0.05)、TNF-α(P<0.001)明显减少。结论外泌体转移tMSC表达的TSP-1可诱导巨噬细胞发生M1极化、CD4+T细胞向Th1、Th17分化,并促进IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌,从而参与胸腺炎症的调节和形成。