阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是临床最常见的老年痴呆类型，典型的临床表现是潜在的进行性的记忆力的减退和认知功能的障碍。目前全球有超过3600万的患者，预计到2050年患者数将达到1.15亿。然而目前并没有有效的治疗措施。大多数学者支持用Aβ瀑布假说(Amyloid Cascade hypothesis)来解释AD的发病机制，该学说强调了Aβ在AD发病中的重要作用。因此，Aβ免疫治疗，阻止Aβ产生、聚集和/或增加Aβ清除被认为是治疗阿尔茨海默病的有效治疗策略。　　 基于基础研究和临床试验的研究结果，Aβ42主动免疫治疗产生的高滴度的抗Aβ抗体不仅能够减少脑内Aβ沉积还能够延缓认知功能的减退。然而，用Aβ42肽段疫苗免疫AD患者时，在Ⅱa期临床试验中有6％的患者感染了脑膜脑炎，因此试验被迫终止。目前认为脑膜脑炎的发生可能与Th1型佐剂QS-21，以及全长Aβ42肽段携带大量的T细胞抗原决定簇有关。此后研究证实Aβ的T细胞抗原决定簇位于16-42区域，是诱导Aβ特异性的T淋巴细胞反应的表位。而Aβ的B细胞抗原决定簇位于在1-15区域，是产生抗Aβ抗体的主要表位。一个长期的随访研究证实了AN1792疫苗免疫并不能阻止AD患者的神经退行性改变。　　 为了获得一个理想的Aβ主动免疫疫苗，我们构建了一个新型的重组质粒疫苗，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3。在此，我们选用了Aβ DNA疫苗，Aβ肽段的B细胞表位和补体C3d-p28分子佐剂。质粒DNA编码的Aβ蛋白能够刺激特异性的抗Aβ抗体的产生，诱发B细胞免疫反应并且无T细胞介导的免疫反应的发生。质粒DNA疫苗优势突出，尤其应用于临床时，我们可以较低的价格进行大规模高纯度的生产，而这将大大利于AD患者。相反，病毒DNA疫苗不能避免病毒的感染与转化，这将大大限制其在临床试验研究中的应用。对Aβ肽段N末端多个小肽段的研究发现Aβ4-10与抗Aβ42抗体的亲和性最大，而第3-6位氨基酸残基EFRH是影响Aβ可溶性或成纤维的主要表位，第3号位氨基酸易于产生寡聚反应并且是导致AD大脑老年斑中Aβ沉积的主要成分。因此，我们选择Aβ3-10，Aβ免疫原最小的有效片段。但肽段越小其抗原性越弱，因此我们将Aβ3-10重复10次序列以增加分子重量，减少肽段的降解。同时加入鼠补体C3d-p28分子佐剂来增强抗原的免疫原性。我们希望重组质粒疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3能够成为阿尔茨海默病主动免疫治疗的候选疫苗。　　 实验方法　　 人工合成补体C3d-p28.3基因片段，与pcDNA3.1(+)-(Aβ3-10)10载体骨架连接。重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3的结构是5’—HindⅢ—kozakse quence-ATG(initiation codon)—10×Aβ3-10—GGGGS linker—BamHI—3×C3d-p28—EcoRI—3’。重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α。重组质粒的纯化和提取使用大量质粒提取试剂盒。重组质粒通过限制性酶切消化法，琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析技术鉴定。通过脂质体2000转染试剂将2μg质粒DNA瞬时转染至HEK293细胞中。质粒的表达通过蛋白质免疫印迹法来检测。实验一:分别将重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，Aβ42肽段和空载体pcDNA3.1(+)用肌肉注射的方法免疫8-10周龄的雌性C57BL/6J鼠。质粒注射前24小时，布比卡因肌肉注射诱导轻微的肌肉变性。应用ELISA方法检测血清抗Aβ抗体的滴度、抗体分型、体外脾细胞培养上清液中IL-4和FN-γ的含量。MTT法检测脾T细胞增殖情况。免疫组织化学染色法检测免疫血清与转基因鼠脑内Aβ斑的结合能力。实验二:分别将重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，Aβ42肽段和空载体pcDNA3.1(+)用肌肉注射的方法免疫12月龄的雌性APP/PS1双转基因鼠。质粒注射前24小时，布比卡因肌肉注射诱导轻微的肌肉变性。应用ELISA方法检测血清抗Aβ抗体的滴度、抗体分型、体外脾细胞培养上清液和脑匀浆中IL-4和IFN-γ的含量、血浆中和脑匀浆中可溶性Aβ42的含量。MTT法检测脾T细胞增殖情况。Morris水迷宫实验评估小鼠空间学习记忆能力。免疫组织化学染色法检测脑内Aβ斑、星形胶质细胞的表达以及免疫血清与转基因鼠脑内Aβ斑的结合能力。脑、心、肺、肝、脾和肾脏用HE染色方法进行形态学检测。普鲁士亮蓝染色法观察脑内有无微出血。　　 实验结果　　 一、质粒成功构建并转染HEK293细胞　　 重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3成功构建，经酶切及测序鉴定序列正确。成功转染HEK293细胞，蛋白质免疫印迹法检测到表达的融合蛋白。　　 二、重组质粒免疫治疗C57BL/6J鼠　　 1、检测血清抗Aβ抗体滴度及分型　　 重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段免疫的C57BL/6J鼠检测出较高滴度的抗Aβ抗体。在空载体pcDNA3.1(+)组中并没有检测出抗Aβ抗体。在p(Aβ3-10)10-C3 d-p28.3组中主要产生了IgG1型的抗体，且IgG1/IgG2a的比值明显高于Aβ42肽段组。　　 2、检测脾T细胞的增殖及细胞因子　　 在重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组中，在相应抗原刺激下，脾T细胞的增殖水平明显高于空载体pcDNA3.1(+)组，但增殖水平低于在伴刀豆蛋白A刺激时。在相应抗原刺激下的脾细胞培养上清液中，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组的IL-4的水平明显高于pcDNA3.1(+)组;Aβ42肽段组的IFN-γ水平明显高于重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)组，且后两组没有统计学上的差异。　　 3、检测免疫血清与APP/PS1双转基因鼠脑内Aβ斑结合情况免疫后的重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和抗Aβ抗体6E10均能够与12月龄的APP/PS1双转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。但是免疫前的血清和pcDNA3.1(+)组并没能与12月龄的APP/PS1双转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。　　 三、重组质粒免疫治疗APP/PS1双转基因鼠　　 1、检测血清抗Aβ抗体滴度及分型　　 重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段免疫的APP/PS1双转基因鼠检测出较高滴度的抗Aβ抗体。在空载体pcDNA3.1(+)组中并没有检测出抗Aβ抗体。在p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组中主要产生了IgG1型的抗体，且IgG1/IgG2a的比值明显高于Aβ42肽段组。　　 2、检测免疫血清与APP/PS1双转基因鼠脑内Aβ斑结合情况　　 免疫后的重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组和抗Aβ抗体6E10均能够与12月龄的APP/PS1双转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。但是免疫前的血清和pcDNA3.1(+)组并没能与12月龄的APP/PS1双转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。　　 3、Morris水迷宫实验评价APP/PS1双转基因鼠的空间学习记忆功能　　 隐藏平台定位航行实验中，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组和Aβ42肽段组小鼠的平均逃避潜伏期明显低于pcDNA3.1(+)组。在探索实验中，1分钟内p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组和Aβ42肽段组小鼠在目标象限花费的时间远多于pcDNA3.1(+)组;并且穿越平台的次数以及穿越目标象限的次数远多于pcDNA3.1(+)组。　　 4、检测脾T细胞的增殖及细胞因子　　 在重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组中，在相应抗原刺激下，脾T细胞的增殖水平明显高于空载体pcDNA3.1(+)组，但增殖水平低于在伴刀豆蛋白A刺激时。在相应抗原刺激下的脾细胞培养上清液中，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组的IL-4的水平明显高于pcDNA3.1(+)组;Aβ42肽段组的IFN-γ水平明显高于重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)组，且后两组没有差异。脑匀浆中检测出的IL-4水平，p(Aβ3-10)10-C3 d-p28.3组略微高于Aβ42肽段组;而IFN-γ水平，Aβ42肽段组略微高于p(Aβ3-10)10-C3 d-p28.3组。　　 5、检测血浆和脑匀浆中可溶性Aβ42的水平　　 在重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组中，血浆和脑匀浆中的可溶性Aβ42水平明显高于pcDNA3.1(+)组。　　 6、检测脑内Aβ斑块和星形胶质细胞的表达和脑内有无微出血　　 在重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和Aβ42肽段组中，皮质和海马沉积的Aβ斑块较pcDNA3.1(+)组大大的减少;与Aβ斑块结果一致，GFAP阳性细胞较pcDNA3.1(+)组大大的减少。3组小鼠大脑皮质、海马、临近的侧脑室和基底节Perls染色均未见染成蓝色的含铁血黄素。HE染色脑和各脏器均见正常结构。　　 结论：　　 1、编码Aβ3-10和补体C3d-p28的重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3成功构建。　　 2、重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫8-10周龄C57BL/6J鼠能够增强抗Aβ抗体的产生并且诱发了Th2型的免疫反应。　　 3、重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫12月龄APP/PS1双转基因鼠产生了具有治疗水平的抗Aβ抗体并且诱发了Th2型的免疫反应。　　 4、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗提高了APP/PS1双转基因鼠空间学习和记忆的能力。　　 5、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗免疫后的APP/PS1双转基因鼠，脑皮质和海马的Aβ斑和星形胶质细胞的表达减少，脑内未检测到微出血现象。