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本文从三方面对条浒苔转化表达系统进行研究:条浒苔原生质体分离培养与再生系统研究、条浒苔细胞转化表达选择标记的筛选和条浒苔外源基因导入与转化表达系统的建立。
本实验首先建立了条浒苔原生质体分离培养与再生技术,探索了条浒苔原生质体分离优化条件,发现用酶法获得条浒苔原生质体时,最佳酶液配方为2%纤维素酶混合2%离析酶,最佳酶解pH为6.5,渗透剂甘露醇浓度为0.6M。通过原生质体培养,观察到条浒苔细胞3种再生发育方式:(1)单细胞可以直接分裂生长形成单细胞苗,有的小苗横裂为8细胞苗后形成有分枝的苗;(2)某些单细胞以不规则方式进行分裂,形成细胞团。细胞团中的细胞可以释放出来形成小苗,并形成小苗簇;(3)某些单细胞分裂只是在原细胞内进行,原细胞即成为孢子囊/配子囊,其子细胞不形成壁,即为孢子/配子。一个孢子囊/配子囊中可含有10个以上的子细胞,子细胞大小不均一。高光强(45μmolm-2.s-1)、高温(20℃)和充气等外界条件下,条浒苔细胞更易于形成孢子囊/配子囊,并放散孢子/配子。
其次本实验进行了条浒苔细胞转化表达选择标记的筛选,研究表明条浒苔原生质体对氯霉素敏感性较高,而对氨苄西林钠、羧苄西林钠、硫酸卡那霉素、G-418、硫酸链霉素不敏感。当氯霉素浓度高达125μg/ml时,原生质体培养两周大部分死亡。然后比较了条浒苔对氯霉素和除草剂Basta敏感性,采用不同浓度氯霉素(0、25、50、75、100、125μg/ml)和Basta(0、5、12.5、25、37.5、50μg/ml)分别对条浒苔游孢子、小苗和成体叶片细胞的杀生作用进行了检测,结果表明,在15天内氯霉素最大浓度125μg/ml对条浒苔游孢子、小苗和成体叶片细胞均难以达到全部杀死效果,其存活率分别为1%、20%和25%;而Basta对条浒苔具有很强的杀生作用,在12.5μg/ml浓度下,Basta在11天内可将条浒苔小苗和成体叶片全部杀死;在25μg/ml浓度下,Basta在7天内可将条浒苔小苗和成体叶片全部杀死;对于条浒苔游孢子,5μg/mlBasta3天内就可以使其全部死亡。这个结果提示了bar基因有可能成为浒苔基因工程较理想的选择标记基因。
最后,本实验开展了条浒苔外源基因导入与转化表达系统建立的研究。采用PEG法转化三种外源DNA分别含有报告基因LacZ基因和GUS基因以及选择抗性基因bar基因。经组织化学染色检测,LacZ基因未见表达,而GUS基因在第3天获得瞬间表达。通过40天Basta压力筛选,转化藻株仍然具有Basta抗性;对经过30天Basta筛选的小苗进行PCR检测,其结果为阳性,进一步表明bar基因已经转入条浒苔细胞内并获得表达。研究结果表明报告基因GUS基因和选择标记基因bar基因可以被用于条浒苔转化表达系统的研究中。