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香草醛香气浓郁,是香料香精中最受欢迎、应用最广泛的品种之一,目前市场上主要有化学合成香草醛、天然香草醛和生物香草醛,近年来,食品安全和环境污染等问题层出不穷,化学合成法因过多使用有机溶剂和危险化学试剂、大量产生废弃物等对环境污染严重,对人体存在着较大的安全隐患;天然香草醛存在于香荚兰豆中,但仅占2%含量（干重）,直接提取成本高,且受种植环境、政府政策等因素影响大,难以满足市场对天然香草醛的需求,人们越发渴望开发一条绿色合成路线来工业化生产天然香草醛。2008年,联合国食品法典委员会在法规中定义:以天然原料为底物,通过物理过程或酶法或微生物工艺制备的香料可视为天然香料。异丁香酚是生产香草醛理想的天然原料,异丁香酚单加氧酶是转化异丁香酚生成香草醛的唯一关键酶,经由能表达该酶的工程菌生产的生物香草醛几乎等同于天然香草醛,但此转化路线存在瓶颈之一是酶活性较低,转化周期长。定向进化是一种能改善酶的性能,甚至创造出新酶的技术手段,本课题对异丁香酚单加氧酶自动诱导表达体系进行了探索,并以课题组前期点突变得到产率提高76.9%的大肠杆菌工程菌E.coli BL21（DE3）-pET30a-iem-F281Q（第281位苯丙氨酸突变成谷氨酰胺,原始菌株为E.coli BL21（DE3）-pET21a-iem）的异丁香酚单加氧酶基因iem-F281Q为初始基因,通过易错PCR构建基因随机突变文库,基于硫代巴比妥酸（TBA）能与产物香草醛反应和96孔板大容量的特性建立了自诱导异丁香酚单加氧酶的96孔板-TBA高通量筛选方法,再以高效液相色谱法（HPLC）进行复筛。主要研究结果如下:1)经SDS-PAGE分析得知,通过自动诱导表达体系成功表达了异丁香酚单加氧酶,为建立该酶的自动诱导表达体系,进一步对该酶的自动诱导培养基主要成分和诱导表达条件进行了优化,最优自动诱导培养基配方为:按胰蛋白胨1.5%、酵母提取物0.25%配成母液ZY;按乳糖5%、甘油25%、葡萄糖浓度2.0%配成母液50×5052;按原配方配制50×M和1000×微量元素,各取20 mL 50×M和50×5052加到958 mL ZY中,高压灭菌,再分别加入2 mL已灭菌的0.75 mol/L MgSO4·7H2O（终浓度为1.5 mmol/L）和0.2 mL 1000×微量元素（终浓度为0.2倍）;最适诱导表达条件为4%接种量接入装有7.5 mL培养基的50 mL锥形瓶中,于200 rpm,30℃诱导表达10 h,以此异丁香酚单加氧酶转化异丁香酚生产香草醛可达到2.04 g/L,比优化前提高了1.5倍。并通过简化该条件下酶活测定步骤,优化测试方法,标准偏差从16%调整到12%,基本满足高通量筛选要求。2)探索了基于中间产物活性氧的可见光分光光度法的高通量筛选方法,此方法操作简便,检测时间短,但剩余的底物异丁香酚会严重影响其吸光值,在本课题中不宜作为高通量筛选方法。而异丁香酚对基于产物香草醛的可见光分光光度法影响较小,与高效液相色谱法的检测结果趋势一致,可将此法作为异丁香酚单加氧酶的筛选方法。3)以异丁香酚单加氧酶基因iem-F281Q为模板,优化了易错PCR反应体系中基因诱变因子Mn2+浓度,其最适浓度为0.05 mmol/L,经由易错PCR构建了阳性率为80%的基因随机突变文库。4)基于上述96孔板-硫代巴比妥酸的高通量筛选方法对940株菌进行初筛,再以HPLC法测定香草醛含量进行复筛,得到一株突变菌株F10,其活性提高至154%,是改造前原始菌株E.coli BL21（DE3）-pET21a-iem产物生成率的2.4倍。经序列分析,与亲本菌株E.coli BL21（DE3）-pET30a-iem-F281Q（第281位苯丙氨酸突变成谷氨酰胺）相比,突变菌株F10共发生了四处突变,其中一处为无义突变,第354位蛋氨酸（ATG）被突变成亮氨酸（TTG）,亮氨酸和蛋氨酸同属非极性氨基酸,但亮氨酸的结构上没有硫原子,推测原因为硫原子易形成二硫键从而影响了底物的结合或产物的释放;第414位谷氨酸（GAA）被突变成缬氨酸（GTA）,即由带负电的极性氨基酸突变成非极性氨基酸;第437位精氨酸（CGG）突变成亮氨酸（CTG）,即由带正电的极性氨基酸突变为非极性氨基酸,说明非极性氨基酸可以促进酶和底物的结合或产物的解离。