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禽白血病(Avian Leucosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus,ASV)群中的病毒感染引起的多种肿瘤性疾病的统称。该病在蛋鸡、肉鸡以及我国地方品系鸡群中都有发生,造成鸡群生产性能降低、免疫抑制、肿瘤性死亡等危害,尤其是ALV感染引起的亚临床感染,导致感染鸡生产性能低下和免疫抑制,从而引起其它病毒和细菌的混合感染或继发感染,导致继发感染或共感染,给养禽业造成重大经济损失。对于禽白血病的防制,目前尚缺乏有效的药物和疫苗,只能通过种群净化来实现对该病的控制。在过去的几十年中,由于未能采取有效地净化措施,禽白血病在养禽地区广泛的流行和散播,致使对其防控更加耗时耗力。因此,亟需探索新的方法控制ALV的散播、减少感染ALV感染的亚临床症状,减少该病带来的危害。目前,多种植物多糖作为新型的添加剂被证明有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射等多种生物学作用。本实验室之前的研究发现泰山松花粉多糖(Taishan pine pollen polysaccharose,TPPPS)能显著增强奇异变形杆菌和禽波氏杆菌亚单位疫苗的免疫效果,促使更强的免疫应答反应;提高獭兔的生产性能;对免疫抑制小鼠有免疫恢复作用。然而,前面所用TPPPS为水提醇沉法所提的总多糖,至今仍不清楚TPPPS中的有效活性成分及相应的生物学特性,因此限制了人们对TPPPS的认识及应用。基于以上考虑,本研究首先分析了TPPPS的成分和理化特性,并鉴定了每种成分的生物学活性;进一步对不同组份抑制B亚群禽白血病病毒(ALV-B)增殖的特性进行了分析;最终,通过建立感染感染ALV-B的鸡免疫抑制模型,探究了TPPPS对ALV-B诱导的免疫抑制的免疫调理和恢复作用,为探索研发防制禽白血病的新途径奠定基础。本研究分以下三部分内容:1.TPPPS部分理化特性和生物学活性的分析1.1 TPPPS的柱层析纯化及各组分分子量和单糖组成的检测为进一步研究TPPPS的功能和发挥作用的机理,本研究将粗提的多糖用DEAE纤维素柱和Sephadex G-200凝胶柱进一步的纯化。结果显示,松花粉多糖主要包括三种组分(分别命名为TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3),并且分离得到了这三种组分的均一多糖。利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和高效液相色谱(HPLC)检测三种多糖组分的分子量和单糖组成。结果表明TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3的分子量分别为56、25和128 k Da。TPPPS由甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等构成,TPPPS1-3组分之间各单糖组成的种类和比例存在明显不同。以上研究结果提示这三种组份可能具有不同的生物学特性。1.2 TPPPS体外抗氧化性、免疫增强活性、抗病毒活性的检测TPPPS各组分的分子量和单糖组成差异显著,表明TPPPS1-3的生物学活性可能存在明显的差异。为了进一步了解TPPPS的生物活性,本研究对TPPPS、TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3的三种体外生物活性进行了检测。结果表明,TPPPS2和TPPPS3显著促进脾淋巴细胞的增殖,并且TPPPS3的效果强于TPPPS2;TPPPS3增强细胞因子白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)的分泌,而TPPPS2仅可以显著提高IL-2的分泌;值得注意的是,TPPPS1没有以上作用,但诱导NO产生的效果最为显著,表明TPPPS1具有最显著的抗氧化活性;50μg/m L TPPPS3对ALV-B增殖作用最为显著,并且作用的主要时期是在病毒的吸附期。本研究为使用TPPPS1-3合理比例的进一步研究可促进有效的免疫调节剂的开发和分析TPPPS的体外的抗病毒机制奠定了基础。2.TPPPS体外抗病毒活性机制的分析2.1阻断ELISA方法的建立为研究TPPPS对ALV-B增殖的显著抑制主要发生在病毒吸附宿主细胞的过程中的机制,本研究根据ALV-B的吸附过程中起重要作用的两个蛋白,病毒的囊膜糖蛋白gp85和宿主的受体蛋白tv-b,建立两个ELISA方法。用原核表达的方法表达出gp85和tv-b蛋白,并制备这两个蛋白的多克隆抗体,用这两个蛋白和抗体建立两个受体-病毒ELISA方法(方法I:gp85—tv-b—tv-b抗体—酶标二抗;方法II:tv-b—gp85—gp85抗体—酶标二抗)。用方阵试验确定ELISA方法的各个条件,结果显示方法I中gp85,tv-b,tv-b抗体的浓度,阴阳性临界值分别是16μg/m L,32μg/m L,1:80,0.178,方法II中tv-b,gp85,gp85抗体的浓度分别是32μg/m L,32μg/m L,1:80,0.194,封闭液和TMB显色时间都是5%脱脂奶粉和15 min。本试验成功建立两个ELISA方法用于分析TPPPS体外抗病毒活性机制。2.2 TPPPS体外抗病毒活性机制的分析利用建立的两个受体-病毒ELISA方法,在gp85蛋白(或tv-b蛋白)包被ELISA板之后加入200μL不同浓度(100,101,102,103,104,105μg/m L)的TPPPS3溶液孵育,进行后续试验观察结果的变化。结果显示,TPPPS3可以显著降低ELISA方法I中的P/N值,对方法II的影响不显著,这表明多糖能与病毒的gp85蛋白的结合,并且不能与tv-b受体蛋白结合,这种结合干扰了病毒与tv-b受体蛋白的结合,这是TPPPS抑制了病毒扩增的机制之一。本研究为进一步认识TPPPS在ALV-B吸附宿主细胞过程中的作用,为研究TPPPS抑制ALV-B在雏鸡体内增殖的机制奠定基础,为TPPPS在禽白血病防制方面的应用提供了依据。3.TPPPS对感染ALV-B雏鸡免疫抑制模型的调理作用3.1感染ALV-B雏鸡免疫抑制模型的建立鸡群感染ALV后可造成1-2%的死亡率(偶尔可达20%或更高),而大部分鸡只有亚临床感染,主要是表现是生产性能下降和免疫抑制。本研究选用50只1日龄雏鸡感染ALV-B,分别在感染后1-9周监测感染鸡的各项生理指标的变化,建立免疫抑制模型,检测指标包括:发病率与死亡率,体重与免疫器官指数,抗ALV-B特异性抗体水平,γ干扰素(IFN-γ)与白介素2(IL-2)水平,T淋巴细胞增殖率,CD4+和CD8+淋巴细胞亚群比例等。结果显示通过对以上指标的检测未发现感染鸡死亡,但其生长状况显著差于正常鸡,并且免疫器官发育迟缓,免疫反应不明显,淋巴细胞活性降低,CD4+和CD4+/CD8+显著下降等。结果表明,感染鸡的免疫系统受到显著地免疫抑制,免疫抑制模型建立成功,为分析感染ALV-B雏鸡的免疫反应变化提供了依据。3.2 TPPPS对免疫抑制模型雏鸡的调理作用据报道TPPPS对环磷酰胺导致的免疫抑制小鼠有免疫恢复作用,本研究通过给感染ALV-B的免疫抑制模型雏鸡颈部皮下注射TPPPS,分析多糖对免疫抑制鸡的免疫调理作用,同时在雏鸡一周龄后免疫新城疫病毒(NDV)疫苗,之后检测各项免疫指标,用以分析TPPPS对感染ALV-B雏鸡免疫抑制模型的调理恢复作用。研究结果显示,TPPPS组雏鸡的体重和免疫器官指数,外周血淋巴细胞增殖率,CD4+淋巴细胞亚群和CD4+/CD8+比值,IL-2和IFN-γ的分泌,和ALV-B的抗体阳性率都显著增加,并且剂量为400 mg/kg(每千克鸡)的TPPPS的效果是最显著的。此外,在400 mg/kg TPPPS组抗新城疫病毒的抗体滴度也显著高于其它试验组。这些结果表明,TPPPS可以用作一种免疫增强剂,以减轻ALV-B造成的免疫抑制现象,为防制禽白血病提供新的思路和途径。