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目的:观察瑞香素(Daphnetin,DAP)诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的影响,探讨瑞香素诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的可能机制。方法:1.Caspase抑制剂作用条件的优化CKK-8法分析4种Caspase抑制剂(Z-DEVD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHDFMK、Z-VAD-FMK),不同浓度(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM),预处理CIA大鼠滑膜细胞不同时间(1 h、2 h、4 h)后,对瑞香素(40μg/ml)抑制滑膜细胞存活率的影响,为后续实验所采用的抑制剂浓度与预处理时间作初步筛选。2.瑞香素诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的机制研究实验分组:(1)Control(vehicle);(2)TP;(3)DAP;(4)DAP+Z-DEVD-FMK;(5)DAP+Z-IETD-FMK;(6)DAP+Z-LEHD-FMK;(7)DAP+Z-VAD-FMK。(1)Hoechst 33258荧光染色观察各组滑膜细胞的凋亡形态;(2)透射电子显微镜观察各组滑膜细胞的超微结构;(3)Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组滑膜细胞的凋亡率;(4)Real-time PCR检测各组滑膜细胞中FasL、TNF、Cyt-c、Bid、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的相对表达量;(5)Cell-based ELISA检测各组滑膜细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的相对表达量;(6)Western blot检测各组滑膜细胞中胞浆和线粒体Cyt-c蛋白的相对含量。结果:1.瑞香素(40μg/ml)作用滑膜细胞48 h可明显抑制滑膜细胞的存活率;采用Z-DEVD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK浓度为5μM,Z-VAD-FMK浓度为20μM,预处理滑膜细胞2 h,与单独瑞香素作用比较,均可明显提高滑膜细胞的存活率。2.瑞香素对滑膜细胞凋亡形态的影响:Hoechst 33258荧光染色后可观察到滑膜细胞对照组细胞核呈均匀的蓝色荧光;DAP组细胞核均出现较多浓染致密的凋亡荧光;Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-VAD-FMK组细胞数量均较DAP组明显增多;Z-IETD-FMK组与DAP组差异不明显。3.瑞香素对滑膜细胞超微结构的影响:滑膜细胞对照组细胞呈椭圆形,包膜完整,核仁清晰;DAP组细胞染色质浓聚,核固缩,胞浆变形并出现许多空泡样结构;Z-VAD-FMK组细胞形态与滑膜细胞对照组差异不明显;Z-DEVDFMK、Z-LEHD-FMK组细胞形态接近滑膜细胞对照组,但染色质仍浓聚,胞浆中有少许空泡样结构;Z-IETD-FMK组细胞凋亡现象较DAP组有所减少,但细胞核变形皱缩明显,胞浆中仍可见大量空泡样结构。4.瑞香素对滑膜细胞凋亡率的影响:DAP组凋亡率明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05);各抑制剂组凋亡率以Z-VAD-FMK组最低,Z-IETDFMK组最高。5.瑞香素对滑膜细胞凋亡通路中相关基因mRNA表达的影响:(1)DAP组中FasL、TNF mRNA表达水平明显高于滑膜细胞对照组及Z-DEVD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-VAD-FMK组(P<0.05)。(2)DAP组中Cyt-c、Bid mRNA表达水平明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05)。(3)DAP组中Bax mRNA表达水平与Bax/Bcl-2 mRNA表达比率均明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达水平明显低于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05)。(4)DAP组中Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达水平明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05),Caspase-9 mRNA表达水平明显高于滑膜细胞对照组及Z-LEHD-FMK、Z-VAD-FMK组(P<0.05)。6.瑞香素对滑膜细胞凋亡通路中相关蛋白表达的影响:(1)DAP组中Bax蛋白表达水平明显高于滑膜细胞对照组及Z-DEVDFMK、Z-LEHD-FMK、Z-VAD-FMK组(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显低于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05),Bax/Bcl-2蛋白表达比率明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05)。(2)DAP组中Caspase-3蛋白表达水平明显高于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05),Caspase-8蛋白表达水平明显高于滑膜细胞对照组及Z-DEVDFMK、Z-IETD-FMK、Z-VAD-FMK组(P<0.05),Caspase-9蛋白表达水平明显高于滑膜细胞对照组及Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-VAD-FMK组(P<0.05)。7.瑞香素对滑膜细胞中线粒体释放Cyt-c的影响:DAP组中胞浆Cyt-c含量明显多于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05),线粒体Cyt-c含量明显少于滑膜细胞对照组及各抑制剂组(P<0.05)。结论:1.瑞香素(40μg/ml)作用CIA大鼠滑膜细胞48 h可明显抑制滑膜细胞的存活率;采用Z-DEVD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK(浓度为5μM)、Z-VAD-FMK(浓度为20μM)预处理滑膜细胞2 h,与单独瑞香素作用比较,滑膜细胞的存活率均可明显提高。2.瑞香素可诱导CIA大鼠滑膜细胞发生凋亡,使之出现典型的凋亡形态学改变以及超微结构改变,不同Caspase抑制剂均可不同程度上阻断瑞香素诱导滑膜细胞凋亡的作用。3.瑞香素可上调CIA大鼠滑膜细胞中FasL、TNF、Bax、Bid、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达以及Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达,下调Bcl-2 mRNA与蛋白表达,不同Caspase抑制剂均可不同程度上阻断瑞香素的这种调节作用。4.瑞香素可促进CIA大鼠滑膜细胞中线粒体释放Cyt-c入胞浆,不同Caspase抑制剂均可不同程度上抑制线粒体释放Cyt-c的效应。综上,瑞香素主要通过Caspase依赖的途径诱导CIA大鼠滑膜细胞发生凋亡;在死亡受体途径与线粒体途径这两条经典凋亡途径中,瑞香素诱导滑膜细胞凋亡的作用又以依赖线粒体途径为主。