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研究目的：探讨SIRT1在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌临床病例学特征之间的关系；以胰腺癌细胞系PANC-1为研究对象,构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,应用短发夹RNA (shRNA)技术抑制SIRT1基因表达,通过稳定转染获得靶向SIRT1基因沉默的胰腺癌细胞,研究SIRT1基因表达水平对人胰腺癌PANC-1细胞增殖能力,非锚定依赖性,成瘤性,化疗敏感性和侵袭能力等生物学行为特性的影响,并初步探讨机制。研究方法：用免疫组织化学染色法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测49例胰腺癌组织和相应癌旁正常胰腺组织中SIRT1的表达,比较SIRT1表达与胰腺癌临床病理学特征之间的相关性；用实时荧光定量PCR和免疫印迹(western blot)法检测比较胰腺癌细胞系PANC-1, AsPC-1, BxPC-3中SIRT1的表达水平,选择SIRT1表达水平最高的细胞系作为RNA干扰研究对象。针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA真核表达质粒和阴性对照、阳性对照真核表达质粒,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,荧光显微镜观察转染效果,实时荧光定量PCR和western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况,通过优化转染条件实现最佳干扰效果,并选取干扰效果最佳的1个shRNA真核表达质粒和阴性对照质粒转染PANC-1细胞,并通过G418筛选稳定转染SIRT1-shRNA的细胞株,流式细胞术检测稳转细胞绿色荧光蛋白纯度。在建立稳定转染细胞PANC-1-Negative细胞和PANC-1-SIRT1-RNAi细胞基础上,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期变化,软琼脂克隆形成实验检测细胞非锚定依赖性生长能力,TUNEL法检测细胞凋亡比例,实时荧光定量PCR和western blot检测凋亡相关基因p53、FOXO3a、Bax/Bcl-2的表达水平,BALB/c裸鼠成瘤实验鉴定各细胞的成瘤能力,活体荧光成像及移植瘤内SIRT1免疫组织化学染色检测SIRT1在体内移植水平,TUNEL法检测移植瘤内细胞凋亡比例,此外,运用MTT法检测PANC-1细胞,PANC-1-Negative细胞,PANC-1-SIRT1-RNAi细胞对化疗药物5-FU和吉西他滨敏感性的变化,并计算各组细胞的IC50；Transwell小室法检测各组细胞侵袭能力的改变,并通过实时荧光定量PCR和western blot检测各组细胞E-cadherin,MMP-2和MMP-9的表达变化。实验结果：SIRT1蛋白在胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率分别为75.51%和22.45%, SIRT1蛋白和mRNA表达水平基本一致,在胰腺癌组织中表达水平明显高于癌旁正常胰腺组织(P<0.01)。SIRT1表达水平与胰腺癌患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴转移、肝转移相关(P<0.01),与患者性别、肿瘤组织分化程度、肿瘤部位、血管浸润、神经侵犯无关(P>0.05)。胰腺癌细胞系PANC-1的SIRT1表达水平在三株细胞系中最高,可作为RNA干扰试验对象。经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR和western blot检测显示SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调；其中以1号重组质粒干扰效应最强。经1号重组质粒和阴性对照质粒转染,G418筛选稳定的细胞株分别命名为PANC-1-SIRT1-RNAi细胞和PANC-1-Negative细胞。PANC-1-SIRT1-RNAi细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平的抑制率分别为95.8%和86.0%。PANC-1细胞、PANC-1-Negative细胞、PANC-1-SIRT1-RNAi细胞的倍增时间分别为(42.76±1.28)h,(44.21±1.95)h,(80.32±6.44)h；与PANC-1细胞和PANC-1-Negative细胞相比,PANC-1-SIRT1-RNAi细胞周期出现显著G0／G1期阻滞,细胞生长受到抑制,非锚定依赖性生长能力亦明显减弱,细胞凋亡比例增高,凋亡基因FOXO3a, Bax的表达明显升高,而p53的表达则无明显变化,抗凋亡基因Bcl-2的表达明显下调,各基因mRNA和蛋白水平表达基本一致,细胞成瘤能力显著下降,且移植瘤中SIRT1的表达持续抑制,细胞凋亡比例显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01), PANC-1细胞、PANC-1-Negative细胞、PANC-1-SIRT1-RNAi细胞对5-FU的IC50分别为117.42±31.19μg/mL,104.54±29.22μg/mL和51.37±18.94μg/mL,对吉西他滨的IC50分别为78.32±15.49μg/mL,72.68±20.11μg/mL和21.47±7.53μg/mL, PANC-1-SIRT1-RNAi细胞的化疗敏感性显著提高(P<0.01)。Transwell小室法检测各组细胞侵袭能力发现,PANC-1细胞、PANC-1-Negative细胞、PANC-1-SIRT1-RNAi细胞的穿膜细胞数分别为(59±13)个,(61±10)个和(22±6)个,PANC-1-SIRT1-RNAi细胞侵袭能力显著下降(P<0.01),与PANC-1细胞和PANC-1-Negative细胞比较,PANC-1-SIRT1-RNAi细胞E-cadherin表达水平升高,MMP-2和MMP-9的表达水平则明显抑制(P<0.01),而PANC-1细胞和PANC-1-Negative细胞之间,各项生物学特性无显著性差异(P>0.05)。实验结论：1. SIRT1在胰腺癌组织中的表达水平显著升高,与患者年龄,肿瘤增殖水平密切相关,并参与胰腺癌的侵袭转移,检测SIRT1的表达有助于判断胰腺癌恶性程度及预后。2.成功构建携带以SIRT1为靶向的shRNA重组质粒；以SIRT1表达水平最高的胰腺癌PANC-1细胞作为RNA干扰研究对象,通过稳定转染SIRT1靶向RNA干扰的SIRT1-shRNA质粒和阴性对照control-shRNA质粒,获得PANC-1-SIRT1-RNAi细胞和PANC-1-Negative细胞；为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础。3.通过SIRT1-shRNA稳定抑制SIRT1在胰腺癌PANC-1细胞中的表达,可显著抑制细胞增殖,减弱非锚定依赖性生长能力,增加细胞凋亡比例,降低细胞成瘤能力,其可能通过凋亡相关基因FOXO3a, Bcl-2/Bax的调节发挥作用。4. SIRT1表达水平的降低,使PANC-1-SIRT1-RNAi细胞对5-FU和吉西他滨的化疗敏感性显著增加,并可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达水平及上调E-cadherin的表达水平,抑制胰腺癌细胞的体外侵袭能力。