论文部分内容阅读
背景:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）感染引起的传染性疾病。作为M.tb的宿主细胞和靶细胞,巨噬细胞被感染后会发生自噬和炎性反应等生物学过程。其中炎性反应有助于机体免疫机制的激活,而过度的炎性反应则会造成细胞和组织损伤;同时,巨噬细胞通过自噬能杀灭入侵的结核分枝杆菌,在二者的相互作用过程中,M.tb也会通过多种机制抑制自噬的发生从而逃避杀伤。M.tb与宿主的相互作用受到多种因子调控,其机制十分复杂。新生儿Fc受体（The Neonatal Fc receptor,FcRn）作为FcγRs家族的一员,在巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和树突细胞等多种细胞中均有表达,其主要功能是将母体中的IgG传递给胎儿。近年来研究发现,FcRn能够通过多种机制调控免疫进程,在人类近端小管（HK-2）细胞中,FcRn会通过与自噬相关蛋白Rab7相互作用影响FcRn在细胞中的循环,进而调控细胞自噬的发生。然而在结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中,FcRn对巨噬细胞自噬的调控作用及其机制尚不明晰。基于以上背景,本研究开展了如下研究内容:目的与方法:为了探究FcRn对BCG诱导的小鼠肺脏炎症损伤和细胞自噬的调控作用及分子机制,利用了以下试验方法:1.收集健康人群和结核病患者外周血,并构建结核分枝杆菌疫苗株BCG（Bacillus Calmette-Guérin）气道灌注C57BL/6J小鼠感染模型,检测M.tb感染前后结核病患者外周血、小鼠肺组织和血清中FcRn的表达差异;进而构建FcRn--小鼠并利用BCG感染,通过HE染色、细胞学检测方法、ELISA和平板涂布等方法评价小鼠肺组织的炎性损伤、免疫细胞分布、炎性因子表达和菌载量变化等情况,从体内水平阐明FcRn对BCG诱导的小鼠肺损伤的调控作用。2.构建RAW264.7和BMDM巨噬细胞BCG感染模型,并设计合成相关小干扰RNA。利用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等技术探究FcRn对BCG诱导巨噬细胞自噬的影响,从体外水平探讨FcRn对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用;进而利用FcRn--小鼠,结合BCG感染,通过免疫组化、透射电镜和Western blot等技术,从体内水平阐明FcRn对小鼠肺组织自噬的调控作用。3.利用雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）来确定FcRn对细胞自噬的调控是否依赖于mTOR途径;通过蛋白质谱技术筛选BCG感染后巨噬细胞中可能与FcRn互作的靶蛋白,进而利用免疫共沉淀和免疫荧光等技术明确二者的相互作用关系;随后设计FcRn互作位点突变质粒,利用免疫共沉淀、免疫荧光和Western blot等技术明确FcRn与靶蛋白的相互作用位点和免疫调控功能,从而阐明FcRn调控BCG诱导巨噬细胞自噬的分子机制。结果:1.与健康人相比,结核病患者外周血FcRn表达水平显著升高（p＜0.01）;在小鼠模型中的研究发现,BCG感染可显著上调C57BL/6J小鼠肺组织和血清中FcRn的表达（p＜0.01）,且呈时间依赖性;敲除FcRn后,BCG感染的小鼠肺组织出现肿大、炎性浸润、组织液渗出等现像,肺部菌载量增多,血清中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达显著上调（p＜0.01）,而抑炎因子IL-4、IL-10和TGF-β的表达显著下调（p＜0.01）;2.体外结果表明:BCG感染后,FcRn在RAW264.7和BMDM巨噬细胞中高表达;BCG感染后敲低/敲除FcRn能够降低RAW264.7/BMDM细胞中自噬相关蛋白ULK1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3Ⅱ的表达,抑制细胞中自噬体和自噬溶酶体的积累;体内结果表明:敲除FcRn会抑制BCG感染的C57BL/6J小鼠肺组织中自噬体和自噬溶酶体的积累,降低自噬相关因子ULK1、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3Ⅱ的表达;3.在BCG感染巨噬细胞过程中,RAPA处理后,敲减FcRn无法降低自噬相关因子ULK1、Atg12、Beclin1和LC3的表达;4.通过IP技术富集BCG感染后RAW264.7细胞中FcRn及其互作蛋白,经蛋白质谱分析与文献调研,确定了YBX1为后续研究对象;随后本研究利用免疫共沉淀和免疫荧光技术,从内源（RAW264.7细胞）和外源（293T细胞）两个水平,明确了FcRn与YBX1存在相互作用关系,且FcRn与YBX1的相互作用会促进YBX1的入核表达;随后构建FcRn的胞质尾区敲除质粒FcRnCT-,免疫共沉淀及免疫荧光试验表明,FcRnCT-未能与YBX1发生互作,且抑制了YBX1从细胞质向细胞核的转位。5.BCG感染后,YBX1在RAW264.7细胞中高表达;敲减YBX1会促进mTOR信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达,并抑制RAW264.7细胞中自噬体的积累。结论:（1）结核病人外周血、BCG气道灌注后小鼠血清和小鼠肺组织中FcRn的表达发生显著上调,提示FcRn可能与结核病病程发展有关;（2）FcRn抑制了BCG感染的小鼠肺组织的炎性损伤,并促进了肺组织自噬的发生;（3）FcRn通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进BCG诱导的巨噬细胞自噬;（4）FcRn通过其胞质尾区与YBX1相互作用,并促进YBX1入核表达;（5）YBX1入核会下调PI3K/AKT/mTOR的表达,进而促进BCG感染的巨噬细胞自噬的发生。