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研究背景与目的肥胖流行广泛,是第六位影响全人类健康的危险因素。肥胖与糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝等代谢综合征的发生密切相关。全基因组关联分析(GWAS)发现,ETV5基因的变异与人类肥胖的发生紧密相关。ETV5是转录因子ETS家族中的一员,可增强或抑制下游基因的表达,调控多种生理过程,如细胞增殖、分化、凋亡等。研究表明Etv5基因敲除小鼠的体重及脂肪量均降低;高脂饮食喂养后,Etv5基因敲除小鼠的体重增加也没有对照组小鼠增加的明显。这提示ETV5在脂肪生成及肥胖发生过程中有重要作用,但其具体作用尚不清楚。本课题以小鼠3T3-L1前脂肪细胞和骨髓间充质干细胞(BMMSC)为细胞模型,研究ETV5在脂肪分化及成熟过程中的作用及作用机制,以期为肥胖症的发生及治疗预防提供新的理论基础。实验方法1.运用细胞培养技术,培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞和BMMSC细胞,并诱导其分化成熟。2.运用RT-PCR和WB方法检测ETV5在3T3-L1细胞分化过程中表达水平的变化。3.运用慢病毒shRNA干扰技术,在小鼠3T3-L1前脂肪细胞和BMMSC细胞中敲减Etv5基因,然后运用RT-PCR和WB技术检测其基因及蛋白表达水平,并采用油红O染色法观察诱导分化的脂肪细胞形态。4.构建pGL3-PPRE、pGL4.20-ICAM-1和pGL4.20-PGC1α荧光素酶报告基因载体,应用双荧光素酶报告基因系统检测转录因子ETV5对PPRE、ICAM-1和PGC1α启动子活性的影响。5.检测在不同能量状态(正常饮食/饥饿/高脂)下小鼠脂肪组织中ETV5的表达情况。结果1.ETV5蛋白表达于脂肪组织和3T3-L1细胞。2.用RT-PCR和WB检测ETV5在3T3-L1细胞不同分化时间点的表达量,发现ETV5在3T3-L1细胞分化的day2表达升高,之后逐渐降低,在day7又有所回升。3.RT-PCR和WB结果表明,慢病毒shRNA干扰技术成功抑制了Etv5基因的mRNA水平和蛋白水平表达。4.Etv5敲减后减少了3T3-L1前脂肪细胞和BMMSC细胞的分化及脂滴生成。5.通过双荧光素酶实验发现ETV5显著上调了pGL3-PPRE的表达。6.禁食2 4小时的小鼠附睾脂肪组织其ETV5蛋白表达水平较正常饮食组显著降低。结论1.ETV5对前脂肪细胞的分化起重要的调控作用。2.ETV5通过激活PPRE调节PPARγ信号通路。3.ETV5水平受营养状态的调控。