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目的:本课题旨在课题组前期研究的基础上,以标记有萤火虫荧光素酶基因的SW480-luc细胞,建立原位结直肠癌NCG小鼠模型,研究蟾灵膏对模型小鼠肝转移的作用机制,并以HIF-1α/SDF-1α通路调控Warburg效应为切入点,探讨蟾灵膏对HIF-1α/SDF-1α及相关因子CXCR4、Akt、AMPK和VEGF蛋白表达水平的影响,从而为蟾灵膏在治疗结直肠癌肝转移方面提供客观、科学依据。方法:采用慢病毒转染方式将萤火虫荧光素酶基因（luc）的植入结直肠癌SW480细胞,通过腺嘌呤霉素筛选目的基因表达稳定的SW480结直肠癌细胞株（SW480-luc）。将收集的SW480-luc细胞进行培养,调整细胞数目为2×107个/ml,接种到NCG小鼠腋下,建立皮下供体瘤,待瘤体生长到1.5cm左右时,取出腋下供瘤体均匀切割为肿瘤组织块,直径大约2mm,利用外科手术方式将瘤体组织移植到NCG小鼠盲肠末端肠壁,建立原位结直肠癌模型诱导肝转移。造模7天后,通过小动物活体成像IVIS? Spectrum系统中检测小鼠生物发光情况,并将造模成功的50只NCG小鼠随机分为模型组（Model）、卡培他滨组（Capecitabine,Cap）、蟾灵膏高剂量组（Changling Gao High,CLGH）、蟾灵膏中剂量组（Changling Gao Middle,CLGM）、蟾灵膏低剂量组（Changling Gao Low,CLGL）,每组 10 只。另将10只正常NCG小鼠设为正常对照组（Normal）,共6组小鼠进行实验。Normal、Model组每只小鼠给予0.1 ml生理盐水灌胃,Bid;CLGH组每只小鼠予以6.0g/kg/d蟾灵膏水溶液0.1 ml灌胃,Bid;CLGM组每只小鼠予以3.0g/kg/d蟾灵膏水溶液0.1 ml灌胃,Bid;CLGL组每只小鼠予以1.5g/kg/d蟾灵膏水溶液0.1 ml灌胃,Bid;Cap组每只小鼠给予0.359g/kg/d卡培他滨水溶液0.1 ml灌胃,Bid。按照上述方法连续给药5 d,暂停2d为1疗程,各组给药周期为3疗程。在给药期间,每天观察NCG小鼠一般生活状况,每间隔3天对小鼠称重并记录,并在造模后第7、14、21、28d时通过小动物活体成像仪观测小鼠腹部移植瘤细胞生长情况。末次灌胃后次日取材:用摘眼球取血法取各组小鼠的血液,取血后脱颈处死后剥离小鼠肠道移植瘤及肝脏,对移植瘤大小进行测量和称重,同时对摘取的肝脏称重并记录并记录肝脏转移瘤数目。对所取标本做如下检测:①HE染色检测小鼠肝脏标本转移瘤情况;②免疫荧光法检测NCG小鼠肝脏肿瘤中与VEGF相关新生血管的差异表达的情况;③ELISA法检测NCG小鼠血清中VEGF蛋白表达情况,肝脏肿瘤中SDF-1α、CXCR4及VEGF蛋白表达情况;④Western b1ot 法检测肝脏肿瘤中 HIF-1α、SDF-1α、CXCR4、Akt、AMPK、VEGF 等蛋白的表达水平,以及Akt、AMPK蛋白磷酸化的情况。结果:构建萤火虫荧光素酶基因稳定表达的结直肠癌细胞株SW480-luc,并将其接种到NCG小鼠盲肠末端。造模后第7d时用IVIS? Spectrum系统对模型鼠进行生物发光检测,发现在每组小鼠造模区域均有发光,表明SW480-luc在小鼠肠壁已经种植成功。随后每7d一次进行成像,结果显示:小鼠盲肠末端瘤块植入区域荧光发光强度及面积随时间逐渐增长。根据荧光强度,发现给药后第7 d,与Model组比较,其余各组的发光强度和发光的面积有下降趋势,但无统计学意义（P>0.05）。给药后第14 d,与Model组比较,Cap组和CLGH组的发光强度和发光面积显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,CLGM组和CLGL组与Model组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。给药后第21d,与Model组比较,Cap组、CLGH组及CLGM组的发光强度和发光面积显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在小鼠体重方面,在灌胃结束后次日称重发现:与Normal组比较,Model、Cap、CLGH、CLGM、CLGL组NCG小鼠体重均有所增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,考虑小鼠因造模后肿瘤持续增大等原因导致造模小鼠体重增长趋势显著;与Model组相比,Cap、CLGH、CLGM组NCG小鼠体重增长相对缓慢,差异具有统计学意义（P<0.05）,考虑与蟾灵膏及卡培他滨灌胃后药物作用导致瘤体生长受到抑制相关。在小鼠腹腔移植瘤体积及肿瘤方面,与Model及CLGL组相比,Cap、CLGH、CLGM组NCG小鼠腹腔移植瘤体积明显减小、瘤体重量明显下降（P<0.05）,且CLGH组与Cap组相比较抑制效果无明显差异（P>0.05）。在肝重及肝脏指数方面,与Normal组比较,其余各组NCG小鼠肝重和肝脏指数明显增加（P<0.05）;与Model组相比,Cap、CLGH、CLGM组NCG小鼠肝重和肝脏指数减轻（P<0.05）;与CLGL组相比,Cap、CLGH组NCG小鼠肝重和肝脏指数降低（P<0.05）。在肝脏转移瘤方面,Normal组小鼠由于未进行肿瘤组织块移植,未生成肿瘤,正常的肝脏表明光滑,肝组织未见炎症水肿,未见局部转移瘤形成,形态规则。其余各组在建立原位结直肠癌模型后,各组小鼠的肝脏表面均发现有大小不一,分布不规则的结节状新生物。其中Model、CLGL组小鼠肝脏结节较多;CLGM组次之,Cap、CLGH组小鼠肝脏转移瘤分布相对较少。相关检测指标提示:①HE结果发现:肝脏表面结节经病理切片诊断为腺样细胞癌,结合小鼠造模情况,考虑肠道来源。Normal组肝组织结构完整,细胞大小基本一致,细胞核边缘清晰,未见胞核深染,细胞质均匀,肝索排列规则,肝小叶结构清晰;Model组肝组织肝索排列紊乱,肝细胞呈不规则密集排列,可见肿瘤细胞密集分布,细胞质缩小,细胞核增大、深染,核质比例增大,出现不对称性、多极性核分裂,细胞异型性明显;Cap、CLGH组肝组织肝索排列尚可区分,肝小叶布局尚存,仍可见异型增生的肿瘤细胞;CLGM组肝索排列较紊乱,可见大、小细胞性异型增生,但较Model组明显减少;CLGL组肝索排列较乱,肝小叶结构基本消失,明显可见大细胞及小细胞性异型增生,核染色质致密。②ELISA结果提示:与Normal组比较,Model组NCG小鼠血清中VEGF及肝转移瘤中SDF-1α、CXCR4、VEGF的蛋白水平显著增高（P<0.05）;与Model组比较,Cap、CLGH、CLHM组血清中的VEGF蛋白水平及肝转移瘤中SDF-1α、CXCR4及VEGF蛋白水平均显著降低（P<0.05）,CLGL组无统计学差异（P>0.05）;与CLGL组相比,CLGH、CLGM组小鼠上述血清及肝转移瘤中对应检测指标蛋白水平显著降低（P<0.05）。③免疫荧光法检测结果提示,VEGF蛋白相关新生血管在Normal组中呈阴性表达（-）,在Model组呈强阳性表达（+++）,在Cap组及CLGH组呈弱阳性表达（+）,在CLGM组呈阳性表达（++）,在CLGL组呈强阳性表达（+++）;④Western blot检测结果显示,与Normal组相比,Model组肝转移瘤中 HIF-1α、SDF-1α、CXCR4、Akt、AMPK、VEGF、p-Akt、p-AMPK 蛋白水平显著升高（P<0.05）;与Model组相比,Cap、CLGH、CLGM组小鼠肝脏中HIF-1α、SDF-1α、CXCR4、Akt、AMPK、VEGF、p-Akt、p-AMPK 蛋白水平显著降低（P<0.05）,与 CLGL 组相比,CLGH、CLGM 组肝转移瘤中 HIF-1α、SDF-1α、CXCR4、Akt、AMPK、VEGF、p-Akt、p-AMPK 蛋白水平显著降低（P<0.05）。结论:（1）蟾灵膏具有抑制原位结直肠癌肝转移模型鼠腹腔移植瘤生长、改善肝脏重量及肝脏指数、减少肝脏转移瘤数目抑制肝脏转移瘤生长的作用;（2）蟾灵膏能够显著抑制原位结直肠癌肝转移模型鼠肝脏转移瘤中HIF-1α、SDF-1α、CXCR4、Akt、AMPK、VEGF、p-Akt、p-AMPK 蛋白水平。因此,我们推测,蟾灵膏对结直肠癌原位模型鼠移植瘤生长和肝脏转移的抑制作用可能是通过影响HIF-1α/SDF-1α轴的信号传导调控Warburg效应,从而改善小鼠体内缺氧微环境对肿瘤生长侵袭的作用,减少肿瘤新生血管的形成而实现的。