背景:乳腺肿瘤是一种恶性肿瘤,目前位于女性肿瘤疾病发病率的第一位,给女性的身体健康和生活治疗带来极大伤害。手术治疗是乳腺癌患者的主要治疗方式,化疗药物治疗是其一般治疗方式,但其长期使用会致使机体产生耐药,并且副作用大,影响的乳腺癌患者的生存质量。因此寻找安全有成效、副作用低的抗肿瘤药物对于乳腺癌的治疗具有重要意义。中医药的在肿瘤疾病的治疗中,显现出多靶点、人体生物利用度较好、副作用小等众多优势,中药地榆的现代药理学研究广泛,体现在抗炎、抗氧化和影响肿瘤血管生成等方面,但其在乳腺癌中的潜在作用和机理有待进一步研究。最近有研究报道,地榆可以抑制乳腺癌自噬而抑制乳腺癌的转移。自噬是一个进化保守和高度调控的过程,在维持细胞动态平衡中起着重要作用。自噬在癌症的发病机理中具有动态和两方面的作用,在肿瘤初期阶段,它抑制肿瘤的形成,而在晚期肿瘤处于饥饿及缺氧的极端微环境时的自噬为肿瘤提供营养物质,确保肿瘤细胞的存活,促进肿瘤的进展。研究表明自噬在乳腺癌、结肠癌、胃癌、口腔癌等诸多肿瘤疾病中均发挥调控作用,目前,通过开发中药探析自噬相关途径对肿瘤疾病的研究引起了大家的关注,但关于地榆与自噬在肿瘤疾病的影响鲜有报道,尤其与乳腺癌相关的研究。此外,地榆与饥饿及缺氧微环境中乳腺癌自噬的作用机制尚不清楚,我们的前期工作发现地榆可以抑制乳腺癌晚期自噬而抑制乳腺癌的转移,但未发现关于地榆是如何影响饥饿及缺氧诱导的晚期自噬,其具体机制未见报道。饥饿及缺氧微环境是肿瘤进程中出现的极端状态。有研究证实缺氧微环境可以诱导自噬,但在乳腺癌的研究中,尚不清楚饥饿及缺氧微环境能否影响自噬水平。缺氧诱导因子1（HIF-1 α）是调节肿瘤细胞应对缺氧环境的关键因子,虽然缺氧诱导自噬的研究已有报道,但其机制尚未阐述清楚。VonHippel-Lindau（VHL）蛋白是一种泛素-蛋白连接酶E3,在常氧下结合并降解被脯氨酰羟化酶羟化的缺氧诱导因子,在氧气缺乏的环境下,由于脯氨酰羟化酶的活性降低,HIF-1 α不断积累并趋于稳定从而促进肿瘤的发生发展,目前未发现地榆与VHL蛋白相关作用的研究。因此,综上所述,我们推测饥饿、缺氧的极端状态也能引起乳腺癌细胞自噬,并且地榆可以削弱营养匮乏状态诱导的自噬从而抑制乳腺癌的进程,其机制可能跟地榆与VHL/HIF-1 α作用有关。目的:本研究旨在探析饥饿及缺氧微环境诱导乳腺癌细胞自噬的证据及地榆对此过程的影响,进而研究在缺氧状态下,地榆对VHL/HIF-1 α的作用机制及其与乳腺癌自噬的关系,为抑制乳腺癌的的机制研究及潜在乳腺癌治疗靶点提供理论基础的研究和体内外实验方面的依据。方法:1.饥饿及缺氧微环境对乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬的影响构建乳腺癌细胞MDA-MB-231极端条件（饥饿及缺氧）:使用Earle’s平衡盐溶液(EBSS饥饿通过诱导高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231不同时间段（Oh、1h、3h、6h、12h、24h）、使用 COCL2不同浓度（0 μM、100 μM、150 μM、200 μM、250 μM、300 μM）构建高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231缺氧模型处理48h后,利用免疫蛋白印迹实验检测观察自噬标志蛋白LC3及P62的蛋白水平改变。2.地榆对饥饿及缺氧微环境乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移侵袭及增殖的影响用Earle’s平衡盐溶液（EBSS）饥饿诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231,同时使用地榆浓度为 100 μ g/ml 处理细胞 24h,48h;用氯化钴（Cobalt chloride,COCL2）200μ M施加构建乳腺癌细胞MDA-MB-231缺氧环境,同时使用地榆浓度为100 μ g/ml处理细胞24h,48h。利用划痕、Transwell和细胞计数测定细胞增殖能力检测施加地榆后乳腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。3.地榆对饥饿及缺氧微环境乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬的影响使用EBSS饥饿诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231,同时使用100 μ g/ml地榆处理细胞,分组为 Ctrl、SA、EBSS、EBSS+SA;使用 COCL2200 μ M 构建乳腺癌细胞 MDA-MB-231缺氧模型,同时使用100 μg/ml地榆处理细胞,分组为:Ctrl、SA、Hypoxia、SA+Hypoxia。以上作用48h后,观察自噬标志蛋白LC3及P62的蛋白水平变化情况。使用EBSS饥饿诱导MDA-MB-231-LC3-MIX细胞,同时使用100 μ g/ml地榆处理细胞,分组为 Ctrl、SA、EBSS、EBSS+SA;使用 COCL2200 μ M 构建 MDA-MB-231-LC3-MIX细胞缺氧模型,同时使用100 μ g/ml地榆处理细胞,分组为:Ctrl、SA、Hypoxia、SA+Hypoxia。以上作用48h后通过激光共聚焦观察乳腺癌细胞自噬通量。4.缺氧诱导因子HIF-1 α与乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬和转移的关系通过pENTER-HiF-1 α质粒转染过表达HIF-1 α和转染SiCtrl、SiHIF-1 α分别干扰处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,24h后WB检测自噬相关蛋白和转移相关蛋白的蛋白水平变化。通过pENTER-HiF-1 α质粒转染过表达HIF-1 α和转染SiCtrl、SiHIF-1 α分别处理MDA-MB-231-LC3-MIX细胞24h后,通过激光共聚焦检测乳腺癌细胞自噬通量。5.地榆对乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549HIF-1 α蛋白水平的影响我们施加地榆100 μ g/ml处理乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞和BT-549细胞48h后,通过PCR实验检测HIF-1 α mRNA水平,观察地榆与乳腺癌细胞HIF-1 α的mRNA转录水平的关系。通过施加地榆50 μ g/ml、100 μg/ml、200 μg/ml分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549,Western Blot检测HIF-1 α蛋白表达。用蛋白酶体抑制剂Mg132联合地榆100 μ g/ml以及蛋白酶体合成抑制剂亚胺环己酮联合地榆100 μ g/ml处理乳腺癌细胞MDA-MB-231不同时间后,通过WB检测HIF-1 α蛋白水平表达。为了明确地榆与VHL蛋白表达的影响,施加地榆50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml剂量组分别处理乳腺癌MDA-MB-231细胞48h和施加地榆100 μg/ml时间组处理乳腺癌MDA-MB-231细胞Oh、24h、48h、72h后,通过WB检测VHL蛋白表达。施加地榆100 μ g/ml处理乳腺癌细胞MDA-MB-231,作用48h后,通过泛素化实验观察地榆与HIF-1 α降解的影响,免疫共沉淀实验检测HIF-1 α蛋白与VHL蛋白的关系。6.地榆对体内乳腺癌的作用构建4周龄16-20g雌性乳腺癌模型,随机分为对照组和地榆组。移植瘤块的第二天对裸小鼠进行监测小鼠肿瘤体积和体重,并通过灌胃,对照组裸小鼠0.9%生理盐水,地榆组为100 mg/kg/d的地榆溶液。5周后对小鼠进行活体成像实验,实时观测地榆对小鼠体内肿瘤大小的影响,再取出小鼠肺脏做HE染色。取材进行组织包埋切片,通过苏木素-伊红染色法和免疫组化染色实验观察地榆对乳腺癌体内的转移作用。结果:1.地榆能显著削弱饥饿及缺氧肿瘤微环境诱导的乳腺癌细胞自噬活性,并伴随着对其明显的增殖、迁移和侵袭抑制作用;2.地榆能有效抑制裸小鼠乳腺癌移植瘤的生长和转移,且对动物无明显毒副作用;3.地榆通过VHL依赖途径促进HIF-1 α蛋白降解,抑制乳腺癌细胞在饥饿及缺氧微环境下激发的保护性自噬,从而抑制乳腺癌的生长和转移。