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背景手足口病是一种由人肠道病毒（Human enterovirus,HEV）引起的,可引起全球范围流行的儿童常见肠道传染病。2008年,手足口病被我国列为丙类传染病之首。目前,引起手足口病的病原体主要为人肠道病毒71型（Human enterovirus 71,EV71）,柯萨奇病毒A组16型（Coxsackie virus A group 16,CVA16）,柯萨奇病毒A组6型（Coxsackie virus A group 6,CVA6）和柯萨奇病毒A组10型（Coxsackie virus A group10,CVA10）。除EV71以外,其它型别均没有有效的疫苗和诊疗手段。因此,建立一种快速、简易、灵敏和特异的实验室检测方法对于手足口病临床确诊和病原体分型,提供精确治疗,防止疫情扩散等具有重要意义。本研究课题拟采用多重Real-Time PCR技术和环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）对临床样本进行快速检测。目的本课题拟建立并优化基于TaqMan探针的多重荧光定量RT-PCR方法和RT-LAMP方法,用以检测EV71、CVA16、CVA6、CVA10等肠道病毒。研究方法1.引物合成及目的片段获取从GenBank数据库中下载EV71、CVA16、CVA6及CVA10的VP1基因,在保守区内设计引物及探针,应用各基因的VP1鉴定引物扩增目的片段。2标准品的制备2.1多重real-time PCR标准品的制备回收纯化目的片段,并连接至T载体,转化至感受态细胞,挑取阳性克隆扩增并提取质粒,10倍梯度稀释后制备标准品。2.2 RT-LAMP标准品的制备回收纯化目的片段,并连接至T载体,转化至感受态细胞,挑取阳性克隆扩增并提取质粒,经体外转录为RNA,纯化后10倍梯度稀释后制备为标准品。3反应体系的优化3.1多重real-time PCR反应体系的优化对于EV71,CVA16,CVA6,CVA10等4种肠道病毒的反应温度、引物及探针浓度等进行优化,探索最佳反应条件。3.2 RT-LAMP反应体系的优化对于肠道病毒CVA6及CVA16 RT-LAMP反应中的甜菜碱浓度,dNTP浓度,Mg2+浓度,SYBR Green I浓度,钙黄绿素浓度及温度等条件进行优化,确定最佳RT-LAMP反应参数。4多重real-time PCR和RT-LAMP两种检测方法的特异性、敏感性和重复性的验证应用设计好的引物及探针对本实验室分离到的肠道病毒各型别分别检测,验证其特异性;应用制备好的标准品对各型别分别制备标准曲线,再次对各型别病毒检测其灵敏性及重复性,应用SPSS软件评估其灵敏性及重复性。5临床样本检测5.1多重real-time PCR检测临床样本使用本实验室建立的多重荧光定量PCR检测体系,对采集的临床样本进行检测。临床样本采用Trizol法提取RNA,经反转录获得cDNA,分别依次进行单重荧光定量PCR、多重荧光定量PCR及肠道病毒通用荧光定量PCR检测,并对阳性样本进行一代测序以验证多重荧光定量PCR检测结果的正确性。5.2 RT-LAMP检测临床样本应用本实验室建立的CVA6及CVA16的RT-LAMP检测体系,对收集到的97份临床样本分别进行检测。临床样本采用Trizol法提取RNA,分别进行RT-LAMP检测及普通PCR检测,并对阳性样本进行一代测序以验证RT-LAMP检测结果的正确性。结果1.本研究建立的多重荧光定量PCR,引物及探针仅在相应模板的孔道出现扩增曲线,说明本研究设计的引物及探针特异性良好。灵敏性检测结果显示,对于EV71、CVA16、CVA6和CVA10的检测限分别在3×103 copies/μl、5×102 copies/μl、4×103copies/μl和4×101 copies/μl,说明本实验设计的引物及探针的灵敏性很高。对临床样本检测结果进行分析发现,肠道病毒通用的荧光定量PCR检测阳性样本数为73,单重荧光定量PCR的阳性样本数为82,多重荧光定量PCR检测的阳性样本为76。多重荧光定量PCR检测阳性样本经一代测序,均为相应的肠道病毒的型别。2.本研究对CVA6和CVA16分别建立了RT-LAMP的检测体系。该检测体系仅在相应的反应通道出现了扩增曲线,而在其他肠道病毒的反应孔道没有出现扩增曲线,说明其特异性高。对于CVA6及CVA16的检测极限分别可达2.0×103 copies/μl和3.0×102 copies/μl,说明其灵敏性较高。在扩增前加入钙黄绿素染料作为反应指示剂,阳性结果呈现由肉眼可见的黄色变为绿色,便于观察。通过对97份临床样本分别应用RT-LAMP与RT-PCR进行检测,RT-LAMP检测结果为97份临床样本中49份CVA6阳性样本,23份CVA16阳性样本,经一代测序均与相应的肠道病毒的型别一致,RT-LAMP检测体系的准确性高。结论1.本研究成功建立了针对肠道病毒EV71、CVA16、CVA10及CVA6的多重荧光定量PCR检测体系,该体系具有特异性好、灵敏性高、通量高的特点。2.本研究成功建立了针对肠道病毒CVA6和CVA16的RT-LAMP检测方法,该方法同样具有特异性强、灵敏性高、操作简单的特点,易于普及。