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本文通过三个试验研究了由本实验室构建的角蛋白酶基因工程菌(P. pastori pPICZaA-kerAopti1)的适宜发酵培养基碳源、重组酶的酶学性质、重组酶对羽毛粉的体外酶解效果及在生长猪上的应用效果,为该酶的开发与应用提供试验数据。试验一：毕赤酵母基因工程菌产酶培养基适宜碳源及重组酶酶学性质分析为进一步提高角蛋白酶基因工程菌(P. pastori pPICZaA-kerAopti1)的分泌水平,降低生产成本,本试验采用30 L发酵罐对该基因工程菌进行小规模诱导发酵,比较葡萄糖和甘油两种不同碳源的产酶效果。结果显示,采用葡萄糖作为培养基碳源时,最高酶活可达568 U/mL,优于甘油作为碳源的效果,并且与摇瓶水平相比提高了150%以上。酶学性质分析结果显示,重组角蛋白酶(PK)分子大小为39 kDa左右,该酶的最适反应pH为7.5,最适反应温度为50℃；该酶在50℃时热稳定性较好,保温30min后酶活几乎没有损失,但60℃时热稳定性不佳；PK对羽毛粉的降解能力优于天青角蛋白。试验二：重组酶对羽毛粉的体外酶解效果为了分析PK对羽毛粉的水解能力,本试验在体外用PK和胃蛋白酶-胰蛋白酶对羽毛粉进行水解。结果显示,只用PK处理时,羽毛粉水解率为14.9%,显著高于空白组和用胃蛋白酶-胰蛋白酶处理的水解率,酶解上清液可溶蛋白含量达到0.15g/L,显著高于胃蛋白酶-胰蛋白酶组,大部分必需氨基酸含量也显著高于胃蛋白酶-胰蛋白酶组。当羽毛粉先用PK处理,再用胃蛋白酶-胰蛋白酶处理,羽毛粉的水解率达到16.56%,上清液可溶蛋白含量显著提高,达到0.28g/L,猪所需必需氨基酸含量均显著提高(p<0.05)。试验三：重组酶在生长猪上的应用效果本试验考察PK在生长猪上的应用效果。选用了60头初始体重为58.1±1.1kg的DLY生长猪,随机分成5个处理,每个处理6个重复,每个重复2头猪。处理组1作为正对照组(玉米豆粕型基础日粮)；处理2-5,以羽毛粉(5%)等氮替代处理1中的豆粕,同时赖氨酸及粗蛋白的含量保证一致,PK的添加量分别为0、3000 U/kg、6000 U/kg、 9000 U/kg。试验期为14天,考察生长猪的生长性能、养分消化率、肠道菌群和血清生化指标。结果显示,与对照组相比,处理2的ADG显著降低(0.890±0.056 kg vs.0.717 ±0.053 kg, P<0.05),大部分必需氨基酸表观消化率均显著下降。添加PK后,生长猪ADG显著提高,并具有剂量效应。与对照组相比,添加9000U/kg组ADG只降低了2.2%(P>0.05)。随着PK添加量的增加,氨基酸表观消化率也随之增加。PK的添加还显著提高干物质、能量、磷和有机物的表观消化率(P<0.05)。直肠菌群的分析结果发现,PK能显著提高肠道乳酸杆菌的含量,显著降低肠道大肠杆菌的含量(P<0.05)。试验期间,采食量与料肉比在各处理组间无差异(P>0.05)。综上结果表明,本研究成功实现了基因工程菌(P. pastoris pPICZaA-kerAwt)的小规模发酵罐发酵产酶,初步确定了葡萄糖为其适宜碳源；体外酶解试验证明,PK可以有效酶解羽毛粉；动物试验表明,添加PK可改善含羽毛粉玉米豆粕型饲粮氨基酸及其他养分的消化率,改善生长猪肠道菌群。