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随着人口日趋老龄化，神经退行性疾病（neurodegenerative disease,ND）已成为严重社会问题。ND可造成患者学习、认知、记忆、运动等功能障碍，严重影响患者的身心健康和生活质量，给社会造成巨大负担。研究表明，ND的发生与成体脑内神经发生异常有密切关系，而五味子等中草药对延迟ND的发生或改善其症状有良好效果。已知脑室下区（subventricular zone,SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus,DG）颗粒下区（subgranular zone,SGZ）是成体脑内存在日常神经发生的2个主要区域。开发我国传统医药资源，探明并确定五味子主要有效成份对SVZ和DG-SGZ神经发生的作用及其分子机制，是应对人口老龄化及ND引发的一系列问题的有效途径之一。五味子素A（Schisandrin A,Sch A）、五味子素B（Schisandrin B,Sch B）是五味子的2个主要有效成分，本课题组前期已经探讨了Sch A、B对小鼠SVZ神经发生的影响。海马区是神经干细胞（neural stem cells,NSCs）存在的主要部位之一，并且与学习、记忆、认知等神经活动的关系更为密切。NSCs是具有自我增殖能力的多能性干细胞，能够分化为不同的神经组织中的细胞（如神经胶质细胞和神经元）。NSCs还具有修复替代受损神经元、分泌神经营养因子、调节神经免疫微环境等作用。目前Sch A、B对体内外NSCs增殖、存活、分化及成体海马DG神经发生的影响尚不清楚。本研究从体外和体内2个方面，探讨了上述问题。
首先以小鼠NE-4C NSCs为实验对象，用Sch A、B进行刺激来构建体外细胞模型，筛选合适的药物作用浓度。随后利用5-乙炔基-2-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）检测细胞增殖，最后利用荧光定量PCR检测端粒酶基因Tert、细胞周期基因cyclin D1及细胞凋亡相关基因（Bcl-2/bax）的表达水平。结果表明，SchA、B均促进NSCs增殖，增强其Tert、cyclin D1的表达；Sch B上调凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，但上调抗凋亡基因Bcl-2表达的效果更加明显，与对照组相比，Bcl-2/Bax的比率升高但差异不显著；Sch A对Bcl-2及Bax转录水平的表达无显著作用。提示Sch A、B对NSCs增殖、存活的促进作用是通过促进Tert、Cyclin D1的表达而实现的。
神经球（neurosphere）是NSCs在体外扩增培养过程中的一般表现形式，是研究神经发育分化的常用体外模型。为了进一步明确Sch A、B在NSCs增殖、分化过程中的作用及其机制，本研究在体外将NE-4C NSCs诱导为神经球。免疫荧光染色显示，诱导形成的神经球为Nestin阳性。随培养时间的延长，Sch A、B对NSCs形成神经球的数量虽无显著影响，但对其直径大小有显著促进作用，其中Sch B尤为明显。对神经元标记Mapt的检测显示，Sch A、B能促进神经球诱导，加速神经元的出现。荧光定量PCR检测显示，Sch B能显著促进神经球特异性标记物Cdh2的表达。进一步研究发现，Sch B对NSCs形成神经球过程中Mmp9、Cyclin D1及β-catenin等Wnt信号通路相关分子的表达有显著影响。这表明，Sch A、B能促进NSCs体外发育分化形成神经球，其机制与Wnt信号通路有关。
在上述体外培养结果基础上，为了进一步探明Sch A、B对体内海马DG区域神经发生的影响，本研究将Sch A、B溶于橄榄油，把成年雄性小鼠分组，分别灌胃投服Sch A、B、橄榄油和生理盐水（空白对照组）2周，灌流固定取脑，冰冻切片后进行免疫荧光染色或普通免疫组织化学染色分析，磷酸化组蛋白H3（phosphohistone H3,PHH3，标记增殖细胞）免疫染色显示，Sch B显著增强了DG中的细胞增殖。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色用于进一步鉴定增殖细胞的类型，可标记NSCs、星形胶质细胞及中间型前体细胞。结果在SchA、B处理组中均观察到了GFAP+细胞的显著增加。此外，与对照组相比，Sch A、B两组中神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear protein,NeuN）标记的成熟神经元总数也显著增多。实验以上结果表明，Sch A、B都是通过增加星形胶质细胞或干细胞的数量并改善DG中间神经元的存活和成熟来增强成体DG中神经发生的。
综上，本研究从体外、体内两方面分别证实Sch A、B对NSCs的增殖、存活、分化及体内神经发生均有促进作用，本研究的结果为我国传统中药资源五味子的神经药理作用研究和开发利用提供了新的思路。
首先以小鼠NE-4C NSCs为实验对象，用Sch A、B进行刺激来构建体外细胞模型，筛选合适的药物作用浓度。随后利用5-乙炔基-2-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）检测细胞增殖，最后利用荧光定量PCR检测端粒酶基因Tert、细胞周期基因cyclin D1及细胞凋亡相关基因（Bcl-2/bax）的表达水平。结果表明，SchA、B均促进NSCs增殖，增强其Tert、cyclin D1的表达；Sch B上调凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，但上调抗凋亡基因Bcl-2表达的效果更加明显，与对照组相比，Bcl-2/Bax的比率升高但差异不显著；Sch A对Bcl-2及Bax转录水平的表达无显著作用。提示Sch A、B对NSCs增殖、存活的促进作用是通过促进Tert、Cyclin D1的表达而实现的。
神经球（neurosphere）是NSCs在体外扩增培养过程中的一般表现形式，是研究神经发育分化的常用体外模型。为了进一步明确Sch A、B在NSCs增殖、分化过程中的作用及其机制，本研究在体外将NE-4C NSCs诱导为神经球。免疫荧光染色显示，诱导形成的神经球为Nestin阳性。随培养时间的延长，Sch A、B对NSCs形成神经球的数量虽无显著影响，但对其直径大小有显著促进作用，其中Sch B尤为明显。对神经元标记Mapt的检测显示，Sch A、B能促进神经球诱导，加速神经元的出现。荧光定量PCR检测显示，Sch B能显著促进神经球特异性标记物Cdh2的表达。进一步研究发现，Sch B对NSCs形成神经球过程中Mmp9、Cyclin D1及β-catenin等Wnt信号通路相关分子的表达有显著影响。这表明，Sch A、B能促进NSCs体外发育分化形成神经球，其机制与Wnt信号通路有关。
在上述体外培养结果基础上，为了进一步探明Sch A、B对体内海马DG区域神经发生的影响，本研究将Sch A、B溶于橄榄油，把成年雄性小鼠分组，分别灌胃投服Sch A、B、橄榄油和生理盐水（空白对照组）2周，灌流固定取脑，冰冻切片后进行免疫荧光染色或普通免疫组织化学染色分析，磷酸化组蛋白H3（phosphohistone H3,PHH3，标记增殖细胞）免疫染色显示，Sch B显著增强了DG中的细胞增殖。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色用于进一步鉴定增殖细胞的类型，可标记NSCs、星形胶质细胞及中间型前体细胞。结果在SchA、B处理组中均观察到了GFAP+细胞的显著增加。此外，与对照组相比，Sch A、B两组中神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear protein,NeuN）标记的成熟神经元总数也显著增多。实验以上结果表明，Sch A、B都是通过增加星形胶质细胞或干细胞的数量并改善DG中间神经元的存活和成熟来增强成体DG中神经发生的。
综上，本研究从体外、体内两方面分别证实Sch A、B对NSCs的增殖、存活、分化及体内神经发生均有促进作用，本研究的结果为我国传统中药资源五味子的神经药理作用研究和开发利用提供了新的思路。