论文部分内容阅读
野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)属于革兰氏阴性菌，能够引起多种十字花科植物黑腐病。在Xcc中存在单拷贝的xccR/pip遗传位点。其中，上游基因xccR编码的蛋白与细菌群体感应转录因子LuxR同源;下游pip基因编码～个重要的致病相关蛋白，脯氨酸亚氨基肽酶(proline iminopeptidase，PIP)。pip基因启动子长为438 bp，通过序列分析，我们发现在pip基因启动子区存在非典型的PIP(plant-inducible promoter) box序列（TTCGC-N4-TTCGC-N2-TTGCC），暗示在pip基因的启动子区存在潜在的HrpX蛋白结合位点。已有的研究发现，很多受HrpX调控基因的启动子区均含有保守的PIP box(序列为TTCGC-N15-TTCGC)，HrpX蛋白特异结合PIP box而调控相应基因的表达。为了研究pip基因的表达是否受HrpX蛋白的调控，我们首先构建了hrpX缺失突变体，通过在野生型和突变体菌株中测定GUS酶活性检测pip启动子/GUS融合基因的表达水平，结果表明，hrpX基因的突变导致pip基因的表达水平显著降低，这在遗传学上证明pip基因的表达依赖于HrpX蛋白。凝胶阻滞(EMSA)实验证实HrpX能够和包含不完整PIP box的DNA片段结合，而这种结合可以被冷探针竞争;ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)-PCR实验显示加入His抗体的样品能够扩增出特异大小的条带，而未加入抗体的阴性对照组没有扩增出条带，通过这两个实验，我们在分子水平上证实HrpX蛋白在体内和体外均特异性结合pip基因启动子区非典型的PIP box。本实验室已有的研究发现，pip基因启动子区存在一个与LuxR特异性结合位点luxbox同源性很高的反向重复序列，luxXc box。XccR蛋白结合在该位点而激活pip基因表达。由于xccR或hrpX单基因缺失突变均造成pip基因表达水平显著下降，因此我们推测XccR蛋白和HrpX蛋白在调控pip基因表达过程中可能存在相互作用。通过HrpX-His和XccR-MBP蛋白的pull-down实验发现，HrpX和XccR蛋白在体外能够形成复合物，暗示这两个蛋白在体内可能协同调控pip基因的表达。综上所述，我们可以得出结论:HrpX能够与pip基因启动子区的非典型PIP box特异结合;并且在调控过程中，HrpX和XccR蛋白协同诱导pip基因的表达。 另外，为了研究pip基因的转录方式，我们进行了5-RACE实验。结果显示pip基因有两个独立的转录起始位点，推测pip基因可能应答不同的环境信号而产生不同长度的转录本。我们分别截取两个转录起始位点上游序列（翻译起始密码子上游255bp-438bp和26bp-254bp的序列）命名为P1和P2。P1包含预测的PIP box;P2包含luxXc box。为了验证P1和P2是否具有独立的启动子活性，我们将P1和P2与GUS基因融合，分别在Xcc8004野生型、hrpX和xccR-突变体中测定P1/GUS、P2/GUS和Ppip438/GUS融合基因的表达水平。初步结果显示，pip基因可能由一个强启动子(P1)和一个弱启动子(P2)驱动，这两个启动子可能共同参与对pip基因的精细调控。