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研究背景： 胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)即血小板衍化血管内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)是嘧啶核苷代谢过程中的一个关键酶,能可逆性催化胸腺嘧核苷转化生成胸腺嘧啶和2-脱氧-D-核糖-1-磷酸,其在体内具有明显的促血管新生和抗细胞凋亡作用。TP同时又是5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体药物5-脱氧氟尿苷(5-deoxy-5-fluorouridine,5’-DFUR,氟铁龙)和卡培他滨(capecitabine,希罗达)等转化为5-FU的一个关键限速酶,与肿瘤的化疗关系密切。已经证实,在肿瘤组织中TP的活性明显高于周围的正常组织,但在不同的肿瘤组织中,TP表达的具体部位、活性和作用却不尽相同。近年来,很多国内外学者研究和我们的前期实验研究均发现人结直肠癌组织及肝转移组织中TP并非癌细胞而主要由间质的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)表达。在结肠癌细胞不表达TP的情况下应用5-FU前体药物,5’-DFUR在组织-细胞中如何转化,是目前仍未解决的问题。而提高结直肠癌组织中尤其是癌细胞中TP的表达水平,对改善结直肠癌患者对氟尿嘧啶类药物化疗的敏感性有重要的临床意义。本实验通过慢病毒转染TPcDNA至人结肠癌细胞SW480和LOVO中,通过抗药基因筛选及流式细胞仪检测确定得到高表达TP的细胞株,探讨转染前后对氟尿嘧啶类药物敏感性、转化5’-DFUR生成5-FU能力的变化及临床意义。 目的： 探讨转染TPcDNA对5’-DFUR抑制人结肠癌细胞SW480和LOVO作用的影响。 方法： 构建包含TPcDNA全长的真核表达载体,用慢病毒包装后转染人结肠癌细胞SW480、LOVO,以流式细胞仪检测转染效率。高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测转染前后肿瘤细胞转化5’-DFUR生成5-FU能力的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染前后SW480和LOVO对5’-DFUR药物敏感性的变化。 结果： 转染TP基因并传代5代后SW480和LOVO细胞的转染效率均在95％左右。HPLC法检测显示SW480-TP、LOVO-TP细胞转化5-DFUR为5-FU的能力分别是亲代细胞的2倍和10倍,差异有统计学意义(p<0.01)。转染TPcDNA后,5’-DFUR对SW480细胞半数有效剂量(IC50)由亲代细胞的(1640.67±53.25)μM下降为(587.2±17.28)μM,差异具有统计学意义(P<0.01),而仅转染载体细胞的IC50为(1630.12±45.91)μM,与亲代细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)。同时,转染TPcDNA后,5’-DFUR对LOVO的IC50由亲代细胞的(1607.33±56.77)μM下降为(1087.67±89.05)μM,差异具有统计学意义(P<0.01),而对仅转染载体细胞的IC50为(1699.52±38.71)μM,与亲代细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 慢病毒载体能够高效地将TPcDNA转染至人结肠癌细胞SW480和LOVO中,所得克隆能够稳定传代,并且转染TPcDNA能够使人结肠癌细胞SW480和LOVO细胞外5’-DFUR转化为5-FU增多,明显提高5’-DFUR对SW480和LOVO的细胞毒性作用。