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家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori Parvo-likevirus,BmPLN)原称为家蚕浓核病毒Ⅱ型(Bombyx mori DensovirustypeⅡ,.mDNV-Ⅱ),是首例动物二分病毒。它是引起家蚕浓核症的重要病原微生物之一。它与家蚕浓核病(BmDNV-Ⅰ)一样,都感染家蚕的中肠组织圆筒形细胞。病毒粒子呈二十面体结构,无囊膜,基因组都为单链线性的DNA并且都含末端重复序列。不同的是,该病毒的基因组分为两个单链DNA分子(VD1,6543bp;VD2,6022bp)且分别独立包装在不同的衣壳中;两条链的末端重复序列有53bp的末端共有序列(CTS),无回文序列;并且含有自身编码的DNA聚合酶。对两条单链序列的分析显示VDl包含四个开放阅读框(ORF1/NS2、ORF2/NS、ORF3/VP和ORF4/DNApolymerase),VD2包含两个开放阅读框(ORFl/NS3、ORF2/Structuralprotein)。其中,非结构蛋白1(NS1)有解旋酶超家族的功能域,具有ATP酶活性,解旋酶活性和DNA结合活性。非结构蛋白2(NS2)与染色体复制起始蛋白dnaA和DNA结合反应调节因子有一定的同源性。而且它们对病毒的复制以及基因表达有很重要的作用。通过Northern杂交以及5’/3’-RACE显示,ORF1和ORF2两个开放阅读框一个1.1kb的转录本中,它们有一个共同的启动子,推测这两个蛋白可能同通过核糖体的选择性起始的方式进行分别翻译的。根据该启动子TATA-box(TATATAA)所在的位置(图距单位5)将其命名为P5。到目前为止,该启动子的特性还没被研究过。
本研究首先从家蚕细小病毒样病毒(中国镇江株)基因组中克隆得到一系列不同长度的启动子片段,然后构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染多种昆虫细胞,用化学发光检测仪检测荧光,分析了该启动子的活性。
本实验主要做了以下五个方面的研究:(1)克隆得到包含P5全长以及CTS在内的片断,并分析其核心功能元件;(2)构建由P5以及“P5+CTS”驱动的萤火虫荧光素酶报告质粒,确定末端共有序列CTS是否参与增强或抑制P5的启动子活性;(3)比较P5在昆虫细胞(BmN、Hi5、Sf9)和哺乳动物细胞(Hela)中的活性;(4)构建一系列正向和反向截短的P5驱动的双荧光素酶报告质粒,确定P5的核心功能域;(5)比较P5与其它几种启动子(BmNPV-ie-1,Bm-actin和3xP3)的活性。
1、BmPLV非结构基因1/2P5启动子的克隆及核心功能元件分析
根据病毒基因组末端序列特征,设计带唯一酶切位点的引物,以裂解的病毒粒子作模板进行PCR扩增,分别获得P5(-1～-236)和“P5+CTS”(-1～-289)并对其进行测序鉴定。通过转录元件搜索系统(TESS)对P5进行分析显示该236bp区域内存在有一个SP1结合位点(-184～-191)、TATAbox(-23～-30)以及转录起始基序TCAGT(-7～-11)等启动子特征序列。
2、通过瞬时表达分析确定CTS是否参与增强或抑制P5的启动活性
将P5和“P5+CTS”片段分别克隆到萤火虫荧光素酶表达载体PGL3-Basic上,构建成PGL3-P5和PGL3-(P5+CTS)然后与内参质粒PRL-SV40分别共转染BmN细胞系。用化学发光检测仪检测荧光素酶活性,结果表明CTS能降低P5启动子的活性。
3、P5在不同细胞系中的活性特异性比较
将构建好的PGL3-P5与内参质粒PRL-SV40分别共转染BmN、Hi5、Sf9和Hela细胞系。结果显示P5在BmN和Hi5细胞中有较高的活性分别是对照数值的18倍和16倍,而在Sf9细胞中活性较低仅是对照数值的4倍,P5在Hela细胞中也有较高的活性约是对照数值的16倍。
4、P5启动子的正反向截短序列活性分析
根据生物信息学预测分析结果,设计6对正反向截短引物以及1对人工合成的包含TATA-box和CAGT-box在内的核心序列,用获得的7个截短的序列分别构建了PGL3-P5、PGL3-(F/1)、PGL3-(F/2)、PGL3-(F/3)、PGL3-(F/4)、PGL3-(F/5)和PGL3-(coredel)。然后分别与PRL-SV40共转染BmN、Hi5和Sf9细胞系。结果表明,-236nt到-206nt间的序列对P5非常重要,对它的缺失导致启动子活性下降到原始活性的36.5%,而TATA-box并不是维持启动子基础活性的必要元件,因为缺失它之后启动子仍存在26.5%的活性。
5、P5与其它几种启动子活性的比较
通过PCR分别获得BmNPV-ie-1,Bm-actin和3xP3启动子,构建成PGL3-iel、PGL3-actin和PGL3-3xP3,然后与PRL-SV40分别共转染BmN和Hi5细胞,结果发现BmNPV-ie-1的活性是P5的800倍,Bm-actin是P5的20倍,3×P3是P5活性的4倍。