米曲霉3.042是一种被广泛用于发酵食品的一种丝状真菌微生物,被认为是安全的食品级发酵菌株。米曲霉3.042中存5种氧化固醇结合蛋白家族蛋白质,分别为Osh1、Osh3、Osh5、Osh7、ORP8,且已有大量研究表明,Osh蛋白质对于细胞内PIPs、胆固醇、氧化固醇等脂质的运输极为重要。因此,探究米曲霉中Osh蛋白质的结构与功能以及在食品发酵过程中的应用具有重要意义。本研究对米曲霉3.042中4种Osh蛋白质(Osh3、Osh5、Osh7、ORP8)做了功能和结构分析,并探究了Osh蛋白质在米曲霉利用、代谢胆固醇及运输麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物过程中的重要作用,为今后此方面的研究奠定了重要的基础。主要研究内容有:1、Osh蛋白质基因的生物信息学分析:从NCBI database获取米曲霉中存在的4个Osh蛋白质的基因序列,并在N末端添加6个His标签后连接到p ET-28载体,通过公司合成4个Osh基因。用Smart online software软件进行蛋白质结构及氨基酸序列分析,结果表明Osh3、Osh5、Osh7、ORP8四个Osh蛋白质均为短链蛋白质,且Osh3中的氨基酸保守序列是“EKVSHRPV”,Osh5中的氨基酸保守序列是“EQVSHHPP”,Osh7和ORP8中的氨基酸保守序列是“EQTS HHPP”。用Protein analysis system Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)在线分析软件分析4个Osh蛋白质的分子质量大小,结果表明Osh3含有485个氨基酸,分子大小为53.47075 k D,Osh5含有417个氨基酸,分子大小为46.26373 k D,Osh7含有445个氨基酸,分子大小为50.09276 k D,ORP8含有431个氨基酸,分子大小为47.79496 k D。2、重组Osh蛋白质的表达、纯化及功能鉴定:因4个Osh蛋白质表达存在差异,故Osh3和Osh5蛋白质只能够在大肠杆菌Transseta DE3细胞进行蛋白质诱导表达,而Osh7和ORP8蛋白质可在大肠杆菌Transseta DE3细胞和大肠杆菌BL21 DE3细胞进行蛋白质诱导表达。因此将构建好的原核表达载体转化到大肠杆菌Transseta DE3细胞进行蛋白质诱导表达,并用His Ni-Agarose Resin进行4个蛋白质纯化,结果表明只有Osh3蛋白质表达量较高,纯化量较大,而其他三种Osh蛋白质纯化量较小。将纯化后的Osh3定量并与9种固醇(豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、7-酮基胆固醇、麦角甾醇、胆固醇、啤酒甾醇、麦角甾醇过氧化物、25-羟基胆固醇)进行MST结合活性分析,结果表明其与豆甾醇结合最强,与7-酮基胆固醇结合活性最低。3、Osh蛋白质在胆固醇代谢及固醇运输过程中的功能分析:通过米曲霉发酵不同碳源的培养基,并对不同时间段菌丝体中胆固醇、麦角甾醇以及麦角甾醇过氧化物含量进行HPLC测定,结果表明以胆固醇为碳源的米曲霉菌丝体中含有胆固醇,且胆固醇含量所占菌丝体百分比在48 h达到了43%,说明米曲霉能够高效利用胆固醇。进一步分析发现,米曲霉利用胆固醇能够促进麦角甾醇转化为麦角甾醇过氧化物。以胆固醇为碳源的米曲霉菌丝体中麦角甾醇含量明显低于以葡萄糖为碳源的米曲霉菌丝体中的含量,而以胆固醇为碳源的米曲霉菌丝体中麦角甾醇过氧化物的含量明显高于以葡萄糖为碳源的菌丝体中的含量。因此,本研究表明米曲霉能够利用并代谢胆固醇,且能够促进麦角甾醇转化为麦角甾醇过氧化物,Osh蛋白质在此过程中发挥重要作用。