[研究背景及目的]动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)所导致的心脑血管等疾病是当今威胁人类健康的头号杀手。血管内皮细胞被覆于血液循环系统内层,对维持血管生理功能及稳态中产生了重要影响。研究证实,血管内皮细胞的表型改变、功能障碍是血管内动脉粥样硬化斑块发生的始动因素,并且伴随动脉粥样硬化相关性疾病的整个过程。因此,防治内皮功能障碍可延缓动脉粥样硬化的发生、发展,减少缺血损伤。微小RNA(microRNA、miRNA)能与mRNA配对,主要通过抑制mRNA翻译或促进其降解调控基因表达进而影响其编码蛋白质的翻译,microRNA不仅参与到生物的生长和发育等许多复杂的生命过程,而且可作为一组新的致病基因参与到许多疾病的病理过程中。MicroRNA-155是一个典型的多功能microRNA,研究证实它在动脉粥样硬化中发挥了重要作用并可能与细胞自噬相关。其表达在粥样斑块组织中明显上调,并参与调控了动脉粥样硬化中组织炎症发生发展和细胞增殖、凋亡的信号转导。在神经、肿瘤学等领域的研究中发现,microRNA-155可能做为一个细胞自噬的调控元件参与了疾病进程。自噬(autophagy)是一种广泛存在于哺乳动物细胞内高度保守的自我消化以及分解代谢的生理过程。通过细胞自噬,胞内变性的蛋白质、衰老以及受损的细胞器被自噬小体转运到溶酶体降解。适度的自噬可帮助细胞维持自体内环境的稳定。然而,过度自噬则引起细胞内溶质及细胞器的损伤,甚至导致细胞自噬性死亡(又称之为Ⅱ型程序性细胞死亡)。越来越多的研究表明,在粥样斑块中氧化修饰的脂蛋白、炎症因子及代谢产物等均可激活细胞自噬,并在疾病的进程中发挥了重要作用,但其确切的分子机制仍不甚明了。因此,深入探讨细胞自噬在动脉粥样硬化中的作用及机制可能为其相关疾病的防治提供新的视角。MicroRNA-155和动脉粥样硬化疾病的进展之间的关系目前还不完全清楚。本研究选择ox-LDL这一 As发生发展中传统与经典的危险因子及自噬发生的诱导因素做为刺激物,从分子、细胞、整体三个水平,以内皮细胞的自噬现象为切入点来研究microRNA-155在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用,力求揭示MicroRNA-155通过对内皮细胞自噬的调控参与动脉粥样硬化斑块发生发展过程中的生物学作用,可望为As斑块的治疗提供理论依据。[方法](1)培养人脐静脉EA.hy 926内皮细胞;(2)用不同浓度以及时间梯度的Ox-LDL处理人脐静脉EA.hy 926内皮细胞,采用qRT-PCR方法检测EA.hy 926内皮细胞内microRNA-155基因表达水平;(3)MicroRNA-155的模拟物、抑制剂以及阴性对照被瞬时转染入EA.hy 926内皮细胞,另细胞内microRNA-155表达上调或下调;(4)用western blot及蛋白免疫荧光实验检测microRNA-155的模拟物及阴性对照转染后EA.hy926内皮细胞LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin1、P62蛋白表达分析细胞自噬水平;(5)采用BAF抑制细胞内自噬初级阶段囊泡形成,再转染microRNA-155的模拟物和阴性对照,用western blot及蛋白免疫荧光实验检测EA.hy926内皮细胞内LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin1、P62蛋白的表达,分析细胞自噬流;(6)Ox-LDL处理EA.hy 926内皮细胞,再转染microRNA-155的抑制剂及阴性对照,用western blot实验检测转染后EA.hy 926内皮细胞LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、P62蛋白表达分析microRNA-155表达下调对ox-LDL处理EA.hy 926内皮细胞细胞自噬水平;(7)采用生物信息学技术预测microRNA-155的目的基因;(8)通过双荧光素酶报告实验证实预测的microRNA-155的目的基因;(9)通过细胞内转染siRNA-Rheb沉默Rheb基因,采用qRT-PCR及western blot 方法检测 Rheb/mTOR基因及通路蛋白表达水平;(10)构建pcDNA.Rheb质粒载体,与microRNA-155共转染入内皮细胞内,通过western blot方法检测LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin1蛋白的表达;(11)采用western blot 方法检测ox-LDL处理组、ox-LDL + microRNA-155 inhibitor处理组、ox-LDL+ microRNA-155 inhibitor +雷帕霉素处理组mTOR通路激活下游蛋白p-mTOR、p-P70S6kinase、p-4EBP1、p-S6蛋白表达水平;(12)采用TUNEL法流式细胞技术及MTS实验检测基因转染后人脐静脉EA.hy926内皮细胞的凋亡水平及细胞活力。[结果](1)在人脐静脉EA.hy 926内皮细胞中,在ox-LDL刺激下microRNA-155的表达明显升高并呈时间及剂量依赖关系(**P<0.01)。(2)上调microRNA-155的细胞内表达可增加LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平,促进P62蛋白降解,激活EA.hy926内皮细胞自噬;(3)在ox-LDL刺激的EA.hy926内皮细胞中下调microRNA-155表达则减少了LC3Ⅱ蛋白表达,抑制了P62蛋白降解,抑制了ox-LDL诱导的内皮细胞自噬。(4)生物信息学分析显示Rheb可能为microRNA-155的目的基因;(5)萤光素酶报告基因检测和western blot实验进一步证实microRNA-155直接通过作用于Rheb的3’-UTR区域从而抑制Rheb表达;(6)沉默Rheb基因抑制mTOR基因转录及蛋白表达,增加Beclin1蛋白表达,促进P62蛋白降解,激活EA.hy926内皮细胞自噬,提示microRNA-155通过抑制Rheb/mTOR信号通路激活内皮细胞自噬;(7)MicroRNA-155模拟物及pcDNA.Rheb质粒载体共转染降低了Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达,抑制了microRNA-155激活的内皮细胞自噬;(8)MicroRNA-155通过作用于Rheb/mTOR/P70S6/4EBP1/S6信号转导通路抑制了 ox-LDL诱导的内皮细胞自噬;(9)MicroRNA-155模拟物促进了ox-LDL刺激下EA.hy 926内皮细胞的凋亡并降低了细胞活力,而在自噬抑制剂存在环境中microRNA-155模拟物却可减少ox-LDL刺激EA.hy 926内皮细胞的凋亡并改善细胞活力。[结论]MicroRNA-155通过直接抑制Rheb/mTOR信号转导通路激活内皮细胞自噬并参与凋亡调控,其可能成为动脉粥样硬化性疾病治疗新的靶点。