背景:微流控芯片实验室又称芯片实验室(Lab-on-Chip)或微流控芯片(Microfluidic chip),与传统实验平台相比,它具有集成度高、成本低、灵敏度高、试剂消耗少和检测时间短等优点。近年来,微流控芯片技术得到迅速发展,由于芯片通道的大小与细胞的微小尺寸相适应,因此微流控芯片已经成为进行细胞功能研究的重要平台。肺癌细胞对化疗药物的耐药始终是肺癌治疗的主要障碍。肿瘤的耐药机制十分复杂,主要与肿瘤细胞基因的特异性有关,也与肿瘤细胞生存的微环境等密切相关。其中与肿瘤特异性因素有关的细胞内耐药相关蛋白的作用一直是肿瘤耐药性研究的热点。这些蛋白中比较有代表性的是P糖蛋白(P-gp)和谷胱甘肽-巯基-转移酶π(glutathione S-transferasesπ,GST-π)。研究表明,P-gp和GST-π的高表达是肿瘤细胞产生多药耐药的重要因素。除了与这些肿瘤特异性因素有关外,肿瘤细胞生存的微环境也是导致肿瘤细胞产生耐药的重要原因。研究发现,肿瘤细胞缺氧的微环境条件可以诱导具有保护作用的葡萄糖调节蛋白(GRPs)的产生,它们可能是肿瘤细胞产生化疗耐药的潜在因素。GRPs中,GRP78和GRP94的研究最多。然而,关于耐药相关蛋白Pgp、GST-π和葡萄糖调节蛋白GRP78及GRP94与肺癌耐药关系的研究目前报道较少,本研究小组曾采用传统实验平台方法对以上几种蛋白与肺癌细胞化疗耐药的相关性进行了分析与探讨,但是由于传统平台的方法步骤繁琐,实验耗时、耗材较多,灵敏度欠佳。因此,在本研究中我们采用微流控芯片这一新兴的技术平台,目的是用低耗材、集成化、更快捷、更灵敏的方法进行肺癌细胞的化疗耐药性研究,本研究内容分为四个部分。研究内容:1.微流控芯片检测平台的构建。选取PDMS为芯片材料,制作含有不同形状及尺寸规格的芯片培养池,用不同浓度的鼠尾胶原溶液对芯片通道进行表面处理,筛选出最利于细胞生长的芯片通道条件。设计不同的芯片通道组合,选出最合理的利于实验操作及实现研究目的单元组合。分别构建两个不同通道组合的芯片体系用于不同介质条件下的细胞培养及肺癌细胞化疗耐药性研究。2.微流控芯片平台中的细胞培养及药物干预研究。分别在两个不同的微流控芯片体系中进行静态介质SPCA1和NCI-H-460及流动介质下的SPCA1细胞培养,然后显微镜下动态观察不同体系中细胞的生长状态。在细胞处于良好生长状态的前提下,分别进行不同芯片体系中细胞分组及药物干预,以实现不同的对照实验条件。3.基于微流控芯片平台的肺癌细胞耐药性检测及分析。细胞培养及分组药物干预后,在用于静态介质细胞培养的芯片体系中,用免疫荧光细胞化学的方法检测SPCA1及NCI-H-460细胞GRP78和GRP94蛋白的表达,用Western-blotting方法进一步证明它们的表达水平;PI染色方法确定细胞在化疗药物作用下的生存率。在用于流动介质细胞培养的芯片体系中,同样采用免疫荧光细胞化学的方法测定细胞P-gp和GST-π的表达,采用Hoechst33342 /PI双染色法确定细胞在化疗药物作用下的生存率。根据两种体系中细胞耐药相关蛋白的表达及细胞在化疗药物作用下的生存率,分析Pgp/GST-π或GRP78/GRP94在肺癌细胞对VP-16化疗耐药中的作用。4.微流控芯片平台与传统实验平台在肺癌耐药性研究中的比较。将两种平台实验进行试剂消耗、操作过程及检测灵敏度等方面进行比较。同样,对微流控芯片检测平台中分别用于静态及流动介质细胞培养的体系之间在细胞培养过程及集成化程度分方面进行了比较。结果:1.微流控芯片检测平台的构建。根据通道条件及芯片设计组合的筛选结果,分别构建了1)多通道平行组合芯片体系,用于静态介质下两种肺癌细胞SPCA1及NCI-H-460的平行培养及肺癌细胞化疗耐药性研究的对照实验。2)含有微阀结构及注射泵驱动功能的微流控芯片体系,用于流动介质下SPCA1细胞培养及P-gp和GST-π表达与肺癌细胞化疗耐药性研究。该体系中以注射泵驱动芯片通道内的液体形成流动介质下的细胞培养条件,以模拟人体生理条件下细胞生长的动态微环境。在含对称U型侧通道的芯片上以普通小夹代替微阀结构达到流体可控的目的,形成平行对照实验条件。2.微流控芯片检测平台中的细胞培养及药物干预研究。在两个不同芯片体系中细胞培养结果显示,无论在静态介质和流动介质条件下,细胞均贴壁及生长良好,但相比之下,流动介质下细胞状态更佳,存活时间也相对更长。将各体系中细胞进行分组(实验组与对照组),两种培养条件下的实验组细胞分别进行了相应的在线药物干预处理。在用于静态介质细胞培养的芯片体系中用钙离子拮抗剂A23187诱导肺癌细胞GRP78及GRP94的表达;在用于流动介质细胞培养芯片体系中用维拉帕米抑制肺癌细胞P-gp的表达,而用依他尼酸(EA)抑制肺癌细胞GST-π的表达。此外,为测定不同组细胞药物作用下的生存率,应用浓度为30μM的化疗药物VP-16对各体系中各组细胞进行凋亡诱导。3.基于微流控芯片平台的肺癌细胞耐药性检测及分析。静态介质的芯片体系中,免疫荧光细胞化学方法及Western-blotting方法检测结果一致,SPCA1和NCI-H-460实验组细胞GRP78及GRP94表达均较各自的对照组细胞明显增高。化疗药物VP-16作用下,两种细胞实验组(A23187作用)生存率均较各自的对照组降低。动态介质的芯片体系中,免疫荧光结果显示P-gp和GST-π在维拉帕米和EA作用下表达明显减弱。而GST-π表达呈胞质分布的绿色荧光,与P-gp组相似,实验组细胞GST-π表达在EA作用后也较对照组明显减弱。在化疗药物VP-16作用下,P-gp实验组SPCA1细胞生存率较对照组明显增加(P<0.05),而GST-π实验组和对照组细胞之间的生存率无明显差别(P>0.05)。4.在肺癌细胞耐药性研究中微流控芯片平台与传统平台的比较。与传统实验平台相比,微流控芯片检测平台上实现了与机体内肿瘤细胞微环境空间相似的原位检测,灵敏度更高。操作方法相对更简单,试剂消耗量也明显降低,整个实验过程从细胞培养到药物处理,耐药蛋白的检测及细胞生存分析均在一张面积几平方厘米的芯片上完成。分别用于不同介质条件细胞培养的两种芯片体系之间:静态培养体系的特点主要体现在检测的高通量优势上。而泵驱动下的流动介质细胞培养芯片体系的优势则在于使芯片微通道内的液体流动,创造了与体内肿瘤细胞生存环境相类似的流动的培养条件。另外用于流动介质细胞培养的芯片体系的优势还表现在有微阀功能参与的芯片体系检测功能的进一步集成化。结论1.构建的两个微流控芯片体系中,多通道平行组合芯片体系可用于静态介质条件下的细胞培养、GRP78/GRP94的表达检测及化疗药物作用下的细胞生存检测。而含有微阀控制结构的芯片体系可用于流动介质条件下的细胞培养、P-gp/GST-π的表达检测及化疗药物作用下的细胞生存检测。2.本部分研究内容得出两个结论1)在两个不同微流控芯片体系上都可以实现不同介质条件下的细胞培养,相比之下流动介质条件更适于细胞生长。2)在不同介质条件细胞培养的基础上完成了细胞在线药物干预。3.本部分研究内容得出两个结论:1)A23187诱导的GRP78和GRP94表达上调与肺癌细胞SPCA1和NCI-H-460对VP-16的耐药有关2)P-gp和GST-π的表达都可被对应的抑制剂维拉帕米和EA下调,然而只有P-gp的下调与SPCA1细胞对VP-16的耐药有关。4.微流控芯片检测平台所得结果与传统检测平台所得结果一致。与传统检测平台相比,微流控检测平台具有检测灵敏度高、实验耗材少、集成化、高通量及在线原位检测的优势。在微流控平台的两个体系中,流动体系较静态体系在细胞培养及功能检测方面则实现了检测功能的进一步集成及自动化,值得进一步研究。