背景:骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种在中老年人群中最常见的退行性关节病变之一,是导致中老年人行走不便及致残的主要原因。OA的主要病理学特征为软骨的退行性变、滑膜炎症以及软骨下骨的重塑。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞类型,因而软骨细胞的稳态对OA的疾病进展起到了至关重要的作用。目前临床上治疗OA的手段和方法均具有一定的局限性且不能逆转OA疾病的病理进程。因此,急需研发出一种新的能延缓骨关节炎进展或对疾病的早期阶段有干预作用的治疗措施。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在动物实验和临床实验中对软骨缺损的治疗具有巨大的潜在价值。近年来,越来越多的研究报道指出干细胞在再生医学中治疗疾病的作用主要依赖于其旁分泌作用。外泌体,是干细胞所分泌到细胞外的一种细胞外囊泡物质。外泌体内包含有多种蛋白质、核酸和脂质,参与了细胞与细胞间的通讯交流。作为直径约为30至150纳米左右的细胞外囊泡小体,干细胞来源的外泌体比干细胞具有更多的优势。如干细胞外泌体在不同的病理生理条件下更加稳定,外泌体治疗时可对其剂量进行更精准的把控,且其几乎不会引起机体的免疫排斥反应。这些独有的优势使得干细胞外泌体成为了诸多科学研究中的热点。在软骨修复方面,近几年来有研究指出干细胞来源的外泌体可极大地增强软骨的修复并起到保护软骨的作用。例如:胚胎干细胞来源的外泌体通过平衡软骨细胞外基质的合成代谢与分解代谢过程保护关节软骨;骨髓干细胞来源的外泌体可抑制软骨细胞凋亡,促进基质的合成并减弱基质的降解,抑制炎性介质的产生,从而保护了关节软骨;过表达miR-140-5p的滑膜干细胞来源的外泌体可以通过靶向RalA而促进SOX9和Aggrecan的生成,延缓了关节软骨的退变。综上所述,间充质干细胞来源的外泌体在OA的治疗中展现了巨大的应用前景。脂肪来源的间充质干细胞因其具有良好的成软骨性能并且易于获取,使其在再生医学中发挥了重要的作用。近几年来,髌下脂肪垫来源的干细胞在软骨修复中取得了一系列进展。有文献报道相对于其他来源的脂肪干细胞,髌下脂肪垫来源的干细胞可特异性分泌软骨表层蛋白(superficial zone protein,SZP),因而对关节腔内软骨组织的修复具有独特的优势。我们团队在前期的研究中发现OA软骨细胞与髌下脂肪垫干细胞共培养可促进成软骨能力,然而这一机制是否与髌下脂肪垫干细所分泌的外泌体有关尚未可知。临床上,髌下脂肪垫可通过关节镜手术获取,因此髌下脂肪垫干细胞外泌体有希望成为治疗OA的新策略。自噬是存在于真核细胞中的一种具有高度保守性的细胞降解代谢途径。许多研究表明自噬在维持软骨稳态中发挥重要作用并且可延缓OA的病理性进展过程。在软骨细胞中,增强自噬可增强II型胶原蛋白和aggrecan蛋白的表达,并减弱软骨基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidase13,MMP13)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)的表达水平。此外,敲除软骨细胞中自噬关键基因Atg5加速了小鼠OA的进展。与此相反的是,特异性敲除mTOR基因,可以通过增强自噬来保护关节软骨。注射mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin),也可增强软骨细胞的自噬水平并减弱OA的病理表型。此外,在小鼠中敲除REDD1基因(mTOR内源性抑制基因)也可加重关节炎中关节软骨、半月板及滑膜的退变。因此,自噬在骨关节炎中起到了至关重要的调控作用,靶向自噬的治疗策略具有良好的临床前景。目的:本研究以OA软骨为模型,探讨髌下脂肪垫干细胞外泌体对软骨的保护作用及其可能的细胞分子机制。方法:1.髌下脂肪垫干细胞的分离提取取临床上经关节置换手术取下的髌下脂肪垫组织,将其浸泡在灭菌的PBS缓冲液中,用组织剪刀将其剪碎,加入0.1%的I型胶原酶,消化10小时,将消化好的细胞悬液用40-μm的滤网过滤,400 g离心5分钟。然后用红细胞裂解液在室温下孵育10分钟。再次离心,接种至10-cm细胞培养皿中,24小时后换液去除悬浮细胞。2.原代软骨细胞的分离提取取关节置换手术取出的关节软骨组织浸泡在无菌PBS缓冲液中,用含有0.2%II型胶原酶的DMEM高糖培养基过夜消化,将消化好的细胞悬液用40-μm的滤网过滤,400g离心5分钟。将离心得到的细胞重悬在DMEM高糖培养基中,然后用红细胞裂解液在室温下孵育10分钟。再次离心,接种至10-cm细胞培养皿中。3.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体的提取用添加无外泌体胎牛血清的细胞培养基培养髌下脂肪垫干细胞,待细胞长到80%融合度时,48小时后取细胞上清液,采取ExoQuick?(EQ)外泌体提取试剂盒以及超滤等两种方法提取外泌体。将提取好的外泌体分装冻存在–80°C。4.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体的鉴定使用NanoSight透射电镜等对外泌体的大小和形态进行观察,使用Western blot方法检测外泌体表面蛋白CD81、CD9和CD63。5.The establishment of DMM-induced OA model in mice通过切除内侧半月板胫骨韧带,建造小鼠内侧半月板不稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)骨关节炎模型,Sham手术为只切开皮肤及关节囊的假手术。6.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体在体内对关节软骨的作用及对疼痛步态的影响建造小鼠内侧半月板不稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)骨关节炎模型后,在不同时间点关节腔内注射髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体或其阴性对照PBS。术后8周取材,对其进行组织学评分和免疫组化染色。同时取另一批小鼠建造内侧半月板不稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)骨关节炎模型,在不同时间点关节腔内注射髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体或其阴性对照PBS。术后10周,对其进Catwalk步态分析。7.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体在体内对OA关节软骨细胞的影响用DiO绿色荧光染料标记髌下脂肪垫干细胞,收集其荧光标记的外泌体,与软骨细胞共孵育,用荧光显微镜观察干细胞外泌体是否可以进入软骨细胞。用CCK-8方法检测干细胞外泌体对软骨细胞活力的影响,用流式细胞仪检测干细胞外泌体对软骨细胞凋亡的影响。细胞划痕实验检测干细胞外泌体对软骨细胞迁移的作用。Western Blot实验以及免疫荧光实验分析干细胞外泌体对软骨细胞外基质合成与分解代谢的影响。8.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体对软骨细胞自噬的影响Western blot实验检测软骨细胞中自噬相关蛋白的表达情况。透射电镜观察干细胞外泌体对软骨细胞中自噬小体生成的影响。使用高通量qPCR方法检测干细胞外泌体处理后软骨细胞中84个自噬相关基因的变化情况。Western blot实验检测干细胞外泌体对mTOR及其下游信号分子P70S6 Kinase(P-p70S6K)表达水平的影响。9.髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体miRNA测序分析使用外泌体miRNA高通量测序对干细胞外泌体中所含miRNA进行分析。双荧光素酶报告实验对SW1353细胞(软骨细胞系)中miR-100-5p对mTOR mRNA的抑制作用。10.小鼠关节腔内注射Antagomir实验DMM手术后小鼠在不同时间点注射antagomir-100-5p/antagomir-NC/干细胞外泌体。术后8周,小鼠处死取材,对其膝关节进行组织学评分以及免疫组化染色。结果:1.髌下脂肪垫干细胞外泌体可显著保护关节软骨DMM手术8周后,小鼠关节发生明显的关节软骨退变,而关节腔注射髌下脂肪垫干细胞外泌体的小鼠关节软骨退变较轻微,软骨形态更加完整,关节表面平滑。关节腔内注射髌下脂肪垫干细胞外泌体上调了软骨基质合成相关蛋白的水平,下调了基质降解相关蛋白的水平。2.髌下脂肪垫干细胞外泌体可部分减轻DMM小鼠的异常步态在DMM术后10周,使用Catwalk实验对小鼠爪印面积、平均爪印强度、脚爪悬空速度和支撑时相比等参数进行分析。发现髌下脂肪垫干细胞外泌体在DMM术后10周对小鼠爪印面积、平均爪印强度、脚爪悬空速度均无明显的改善作用,但却对支撑时相比有明显改善作用。7.髌下脂肪垫干细胞外泌体可抑制软骨细胞凋亡并促进软骨细胞的合成代谢髌下脂肪垫干细胞外泌体可减弱白介素1β(IL-1β)对软骨细胞的细胞活力的负性影响并减弱白介素1β(IL-1β)对软骨细胞凋亡的影响。同时髌下脂肪垫干细胞外泌体也可增强软骨细胞II型胶原蛋白的表达,降低MMP13和ADAMTS5的表达。8.髌下脂肪垫干细胞外泌体通过抑制mTOR信号通路增强软骨细胞自噬髌下脂肪垫干细胞外泌体增强了自噬蛋白LC3-II的表达水平并降低SQSTM1/P62的表达水平。电镜实验和GFP-LC3荧光实验结果提示髌下脂肪垫干细胞外泌体显著增加了软骨细胞的自噬小体数量。髌下脂肪垫干细胞外泌体显著下调了mROR及其磷酸化的水平。使用自噬抑制剂巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1)后,髌下脂肪垫干细胞外泌体所介导的软骨细胞自噬增强作用即被减弱。在软骨细胞中敲除自噬相关蛋白7(autophagy related7,ATG7)之后,也起到相似作用。9.髌下脂肪垫外泌体所富含的miR-100-5p可抑制mTOR基因的表达通过miRNA测序结果发现干细胞外泌体中含量最高的前五个miRNAs分别是miR-100-5p、let-7i-5p、miR-221-3p、hsa-miR-21-5p和miR-148a-3p,占到了外泌体总miRNA中的43.9%。双荧光素梅报告实验也验证了髌下脂肪垫干细胞外泌体中miR-100-5p对mTOR基因转录的抑制作用。10.关节腔内注射antagomir-100-5p可削弱外泌体对DMM小鼠的关节软骨保护作用小鼠关节腔内注射antagomir-100-5p(miR-100-5p抑制剂)减弱了干细胞外泌体对小鼠关节的保护作用并抑制了干细胞外泌体所介导的自噬增强作用。结论:基于以上本研究的结果得出以下结论:1.髌下脂肪垫干细胞外泌体可保护OA小鼠软骨并改善小鼠的异常步态;2.髌下脂肪垫干细胞外泌体可促进OA软骨细胞增殖、抑制OA软骨细胞凋亡、促进软骨基质的合成并增强OA软骨细胞的自噬水平;3.髌下脂肪垫干细胞外泌体可通过miR-100-5p所介导的mTOR自噬通路发挥软骨保护作用。