肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury,HIRI)常继发于严重创伤、失血性休克所致肝缺血后、肝脏大手术需行肝门阻断、肝脏移植术后,是由多重因素造成的一个复杂的病理生理过程。目前研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在一定程度上具有细胞自我保护作用,适度的ERS会启动细胞生存途径,但应激反应程度过强或时间过长,ERS会导致组织损伤,使细胞发生凋亡和坏死。已发现ERS介导的细胞凋亡在肝脏缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用。研究证实：肝缺血再灌注时应用丹参(Radix Salvia miltiorrhiza,RSM)预处理,可通过减轻钙超载和脂质过氧化自由基损伤发挥细胞保护作用,但其作用是否与调节ERS有关尚不得而知。本实验通过观察大鼠肝脏缺血再灌注时RSM对活化转录因子6a(activating transcription factor-6α,ATF-6α)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cysteinylasparate specific proteinase-12, Caspase-12)表达的影响,探讨其是否可通过调节内质网(endoplasmic reticulum, ER)稳态发挥肝保护作用。目的建立大鼠肝脏缺血再灌注模型,观察活化转录因子6α(ATF-6α)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达情况及丹参对其表达的影响,探讨肝脏缺血再灌注时活化转录因子6α(ATF-6a)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)的差异表达、丹参对ERS的具体调节机制。方法1.健康雄性Wistar大鼠80只随机分为正常对照组(n=5只)、假手术组(n=25只)、缺血再灌注组(n=25只)和丹参预处理组(n=25只),假手术组、缺血再灌注组及丹参预处理组又按不同再灌注时限(Oh、3h、12h、24h、72h)分为五个亚组,每组5只大鼠。2.正常对照组断颈处死后开腹切取肝组织；实验各组大鼠以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口,假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂；缺血再灌注组进腹后向上牵开肝脏,显露并游离肝十二指肠韧带,在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min后去除动脉夹、使血液复流,制备缺血再灌注损伤模型。假手术组和缺血再灌注组断流前30min经尾静脉注入生理盐水40ml/kg;丹参预处理组动物模型制备同缺血再灌注组,断流前30min经尾静脉推注丹参注射液6ml/kg(正大青春宝药业公司,批准文号：国药准字Z33020177)加生理盐水稀释至40ml/kg。实验各组大鼠于不同再灌注时限断颈处死,开腹切取肝组织分别置于10%甲醛中固定和液氮中保存待检。3.大鼠肝脏标本取材后左外叶经10%福尔马林固定,用于HE染色及免疫组织化学染色。中叶置于液氮中保存,用于免疫印迹法(Western blot)检测ATF-6α及Caspase-12蛋白的表达。4.HE染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠ATF-6α和Caspase-12的工作浓度为1：100,均购于武汉博士德生物工程有限公司。5.光镜下进行病理组织学观察,免疫组织化学SABC法检测ATF-6α及Caspase-12在肝脏不同缺血时限的表达量,采用Image pro-plus6.0软件分析免疫组化图片方法：每组内每张切片随机挑选10个200倍视野进行拍照,对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞的积分光密度值(IOD)。6.免疫印迹法(Western blot)检测各组ATF-6α及Caspase-12蛋白的表达：兔抗大鼠p-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),兔抗大鼠ATF-6α单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),兔抗大鼠Caspase-12单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所),PVDF膜(Millipor公司),柯达医用X射线胶片(Kodak公司)。各组织块于-80℃冰箱保存,加细胞裂解液提总蛋白,用Bradford法进行蛋白定量。取等量样品40gg,在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液使其终浓度为1×,95℃处理5min。蛋白质变性处理,SDS-PAGE电泳分离,转移至PVDF膜,转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)封闭1h之后加入一抗(1：500稀释)4℃过夜；用硫代巴比妥酸(TBS)缓冲液洗涤3次,每次5min；加入标记的二抗(1：3000稀释)室温孵育1h,用化学发光法Eclplus显色,X线底片曝光,将胶片进行扫描,用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。以目的条带光密度值与对应β-actin的光密度值之比作为样本蛋白表达的指标。7.所有计量数据应用SPSS13.0进行统计学处理,采取析因设计方差分析分析主效应与交互效应后,LSD法检验各组间差别,P<0.05为具有统计学差异的判定标准。结果1.病理形态学观察结果：400倍光学显微镜下观察,可见正常对照组及假手术组肝小叶结构基本完整,肝细胞连续成索,胞核大而圆；缺血再灌注组肝脏组织损伤最严重：Oh可见肝细胞轻至中度水肿,肝窦间隙变窄；3h时可见肝细胞肿胀明显,胞浆疏松化,部分出现嗜酸样变；12h时损伤最重,可见肝小叶变形,部分出现片状坏死；24h时损伤略轻于12h；72h时可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构；相同时限点丹参预处理组较缺血再灌注组损伤程度和损伤范围有明显减轻：0h可见肝细胞轻度水肿；3h时可见肝细胞中度水肿,部分细胞胞浆疏松化；12h时损伤较重,可见肝小叶变形,少量片状坏死；24h时损伤略轻于12h;72h时可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构,肝细胞增生。2.ATF-6α蛋白的表达：Western blot法分析结果显示：正常对照组与假手术组ATF-6α的表达无统计学差异(P>0.05)；而缺血再灌注组在缺血45min再灌注3h即明显升高(1.8±0.129),12h达到峰值(2.606±0.273),24h仍处于相对高水平(1.916±0.215),72h虽有下降(1.366±0.088),但仍显著高于假手术组(0.425±0.031)和正常对照组(0.426±0.027)(P<0.01)。同期丹参预处理组ATF-6α的表达虽高于正常对照组和假手术组<0.01),但明显低于缺血再灌注组各观察时限点(P<0.01)(见图1)。免疫组织化学法分析结果显示：ATF-6α主要表达在肝细胞胞浆及胞核内。正常组和假手术组中央静脉周围可见较少的阳性细胞,缺血再灌注组再灌注0h在中央静脉和汇管区见阳性细胞表达,且表达水平增高,3h后表达信号在中央静脉中外1/3带持续增强,12h达到高峰,阳性细胞布满整个肝小叶,24h仍处于相对高表达水平,至再灌注72h表达强度较12h显著降低(P<0.01),仍高于正常对照组和假手术组,阳性细胞范围集中于中央静脉周围。丹参预处理组ATF-6α蛋白表达水平高于正常对照组和假手术组,但与同期缺血再灌注组比较：中央静脉周围阳性细胞范围相对较小。损伤组和丹参组免疫组化各时限点积分光密度值的强度变化趋势与Western blot法所测定的蛋白定量变化趋势基本一致。3. Caspase-12蛋白的表达：Western blot法分析结果显示,正常对照组与假手术组Caspase-12的表达无统计学差异(P>0.05)；而缺血再灌注组在缺血45min再灌注3h即明显升高(2.394±0.485),12h达到峰值(2.89±0.357),24h仍处于相对高水平(1.896±0.115),72h虽有下降(1.59±0.110),但仍显著高于假手术组(1.241±0.046)和正常对照组(1.236±0.038)(P<0.01)。同期丹参预处理组Caspase-12的表达虽高于正常对照组和假手术组(P<0.01),但明显低于缺血再灌注组各观察时限点(P<0.01)。免疫组织化学法分析结果显示,Caspase-12主要表达在肝脏细胞胞浆。正常对照组和假手术组Caspase-12蛋白染色阳性细胞在中央静脉周围表达较弱,缺血再灌注组再灌注0h中央静脉周围阳性细胞数增多,3h后表达信号持续增强,12h整个肝小叶都可见表达,24h、72h仍处于相对高水平,但范围集中在中央静脉周围,显著高于正常组和假手术组(P<0.01)。丹参预处理组Caspase-12蛋白表达水平显著高于正常对照组和假手术组,但与同期缺血再灌注组相比Caspase-12蛋白表达有明显下降(P<0.01),表现为中央静脉和汇管区周围Caspase-12阳性细胞的表达范围较小,积分光密度值较低。讨论本实验研究结果表明：肝脏在遭受缺血45min后再灌注0hATF-6α的表达即开始升高,3h、12h和24h都保持在高表达的水平,12h到达峰值,72h时虽然低于峰水平,但仍高于正常对照组和假手术组。由此提示,ATF-6α作为通过内质网应激调节内环境稳定的重要作用分子,参与了肝脏遭受缺血及再灌注损伤的0h～72h期间全程的调节作用。ATF-6α在再灌注后0h及3h时在中央静脉及汇管区附近的表达最强,12h时阳性细胞表达密度均一,其原因可能是由于在缺血期中央静脉血液氧分压最低,细胞缺氧最严重；而在再灌注期,氧自由基、代谢产物大量聚积于中央静脉,进一步加重了中央静脉周围肝细胞的损伤程度,ATF-6α通过增强未折叠蛋白反应而实现的细胞保护作用,也首先从损伤较重区域的肝细胞开始。这与本课题组前期研究曾观察到的IGF-1及p53mRNA作为内源性保护因子、再灌注3h开始在血管区周围开始表达的时空分布特点基本一致Caspase-12是特异性的内质网应激诱导细胞凋亡的重要调节因子,在死亡受体或线粒体凋亡通路中不被活化,只能被ERS激活并介导线粒体非依赖性的细胞凋亡。在本实验中Caspase-12与ATF-6α的时空表达趋势十分相似,均为0h～3h表达即上调,在中央静脉及汇管区附近的分布较密,12h达峰值,可见整个肝小叶大部分细胞表达,24h和72h仍处于高水平表达,集中表现在中央静脉周围。提示缺血45min以及随后的再灌注损伤对大鼠来说是一个较大的打击,随着再灌注损伤进行,过度的ESR在发挥ATF-6α调节作用的同时,也触发了经内质网途经的Caspase级联细胞死亡程序的活化,由于中央静脉周围是氧分压最低、缺氧反应最重的区域,因而也是易发生细胞死亡的最主要区域,这可能是该区域再灌注后易发生无复流现象(no-re flow)的主要原因之一。此结果提示,丹参的保护作用与减轻过度的ERS反应密切相关。其机制可能为：丹参通过改善微循环和抗氧化作用,为肝细胞提供一定的能源底物,促进代谢活动的正常进行,减少酸性代谢产物、过氧化物以及大量未折叠蛋白的堆积,进而减轻过度的内质网应激,使ATF-6α的表达处于一个相对适宜的状态；同时,丹参确切的钙调节作用有助于维系被称为‘钙库”的内质网内稳态的平衡,这对于富含内质网的肝细胞具有特别重要意义。丹参通过以上综合因素,减轻了细胞受损程度,从而在一定程度上减弱了以Caspase-12为特征的经内质网途径Caspase细胞死亡程序的活化表达,综合发挥细胞保护作用。