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根据HPeV衣壳蛋白VP1基因设计引物,扩增出696bp大小的目的片段,并将其克隆到pET-28a表达载体上,经酶切、测序鉴定后,将该质粒转化入E.coli Rosetta (DE3)中,通过IPTG诱导、SDS-PAGE检测结果显示,VP1基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达。以盐酸胍溶解液溶解包涵体蛋白,用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,4℃条件下复性。经Western-blot检测表明,该重组蛋白能被HPeV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。用表达的VP1重组蛋白作为包被抗原,建立了检测抗HPeV抗体的间接ELISA方法。经对ELISA的最佳工作条件测定结果表明,抗原最佳包被浓度为3.7μg?ml-1,最适包被条件为37℃2h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,待检血清最佳稀释度为1:400,最适作用条件为37℃1h,羊抗人IgG最佳稀释度为1:5000,最佳显色时间为10min,阴阳性临界值为0.1701。经重复性试验和特异性实验结果显示,建立的ELISA方法具有良好的可重复性;与猪链球菌2型、人星状病毒、人博卡病毒、戊型肝炎病毒阳性血清抗体均无交叉反应。利用已建立的ELISA方法检测257份临床儿童血清样品,检出HPeV总阳性率为73%。根据HPeV八个基因型的参考毒株全序列,针对5‘端非编码区保守序列设计特异性引物,经过反应条件的优化,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并与常规套式RT-PCR检测方法进行比较。结果表明,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μl,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeV的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。