【摘 要】
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半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶。线虫的半胱氨酸蛋白酶大多表达在虫体的食道腺、肠细胞中,发挥其水解活性,是线虫
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半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶。线虫的半胱氨酸蛋白酶大多表达在虫体的食道腺、肠细胞中,发挥其水解活性,是线虫的主要“消化酶”。半胱氨酸蛋白酶在线虫的入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需要的营养成分、蜕皮、消化宿主蛋白、免疫逃避等过程中发挥关键作用,与多种重要动植物疾病密切相关,是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。已有大量报道证明半胱氨酸蛋白酶在动物寄生性线虫、自由生活线虫的发育、免疫活性等方面都具有关键作用。而在植物固着性寄生线虫(如大豆胞囊线虫、根结线虫)中的几例报道也预示了它的重要性,而在植物迁移性寄生线虫中至今未见对其的报道。因此,本研究分别从两种植物迁移性内寄生线虫:松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和相似穿孔线虫(Radopholus similis)中分离得到半胱氨酸蛋白酶基因全长及片段,并对松材线虫半胱氨酸蛋白酶进行原核表达。本研究为进一步测定蛋白酶活性,更好的了解此蛋白酶的功能奠定了理论基础,也为植物寄生性线虫的防治提供新的靶标和思路。主要研究结果如下:1.克隆基因全长:采用同源克隆法,首先筛选GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中收录的线虫半胱氨酸蛋白酶(CP)的氨基酸序列,利用DNAman软件进行同源比对分析并根据植物寄生性线虫CP密码子偏好设计简并引物,通过RACE法获得植物迁移性寄生线虫:松材线虫、相似穿孔线虫CP基因的cDNA全长并进行深入分析。本研究从松材线虫中得到两个L型半胱氨酸蛋白酶基因,分别命名为Bx-CPL1、Bx-CPL2,其cDNA全长分别为1220 bp、1161 bp,GenBank登录号依次为EU651860、EU659123;从相似穿孔线虫中得到一个L型半胱氨酸蛋白酶基因和一个S型半胱氨酸蛋白酶基因,分别命名为Rs-CPL1和Rs-CPS,其中Rs-CPL1的cDNA全长为1388 bp,登录号EU659124;Rs-CPS cDNA全长为1112 bp,登录号EU659125;同时从相似穿孔线虫中得到498bp的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA片段。生物信息学软件详细分析以上序列及构建系统发育树,结果证明这四个基因全长及一个cDNA片段均具有CP家族的典型特征。2.基因DNA全长扩增:以松材线虫基因组DNA为模板,扩增松材线虫两个CP基因Bx-CPL1、Bx-CPL2的DNA全长,结果表明松材线虫这两个目的基因均由3个外显子和2个内含子组成,获得了松材线虫CP基因结构上的基本信息。3.原核表达:通过双酶切、连接分别构建Bx-CPL1、Bx-CPL2的表达载体,将Bx-CPL1基因、Bx-CPL2基因成功的克隆到表达载体pET-28a(+)多克隆区域上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导得到目的融合蛋白pET-28a-Bx-CPL2的表达,而pET-28a-Bx-CPL1未能得到可见表达。所得的pET-28a-Bx-CPL2的原核表达为下一步提纯融合蛋白、Western blot、验证蛋白酶活性提供依据。
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