目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种渐进性退行性关节疾病,在老年人群中最常见,男女均可发病。骨性关节炎是膝关节最常见的疾病,其他负重较大髋关节、脊柱等部位亦可发病,此外,手部关节也是本病的好发部位。到目前为止,病因仍然不清楚。其主要的病理特点是:关节软骨变性、关节边缘骨质增生伴骨赘形成、软骨下硬化重塑、关节滑膜的慢性炎症等;主要的相关因素包括年龄、性别、种族、遗传、体重、生活习惯、慢性劳损、创伤、原发性或继发性关节畸形等。它与关节的慢性疼痛、功能障碍和残疾有关,导致生活质量下降和严重的社会经济负担,是世界范围内的主要健康问题之一。随着老龄化的发展趋势和肥胖人口越来越多,迫切需要大量增加医疗卫生服务,以应对日益严重的骨性关节炎这种慢性疾病。纵观全球,骨性关节炎是严重威胁中老年人群身体健康和降低生活质量的一种慢性关节疾病,是巨大的健康问题、经济问题和社会问题,所有的研究和努力到目前为止还不能确定其确切的病因。目前,骨性关节炎仍然缺乏有效的预防措施、干预方法和治疗手段。现在的治疗理念主要集中在症状的缓解和关节残疾的改善,而不是改变疾病的进展。对于终末期的骨关节炎来说,关节置换手术是一种有效的治疗方法;早期、中期的OA除了姑息性疼痛控制和物理治疗外,目前尚无合理的治疗方法。没有任何治疗方法能够令人满意地停止或延缓OA进展,或提供有效和持久的症状缓解。所以,骨性关节炎在临床医疗中预防、诊断、治疗的困境不得不使得科研人员开始研究如何避免骨性关节炎的发生、减缓骨性关节炎的发展或逆转关节软骨结构破坏的新方法,进而来防止晚期骨性关节炎的发生,减轻社会经济负担,提高人民的生活质量。针对关节软骨的破坏或者软骨细胞的凋亡、关节软骨下骨重塑或关节滑膜慢性炎性改变过程的新治疗方法的开发,需要研究真更加深入地了解这些干预措施是如何在这些病理改变过程中发挥作用的。自1982年Nusse和Varmus首次发现Wnt以来,随着学者们对Wnt基因家族的研究,Wnt基因家族成员逐渐被我们认识。过去的一些研究已经充分证明,Wnt家族成员参与其细胞增殖、细胞迁移、一系列复杂的代谢途径等活动中。另外一些研究证明,Wnt信号传导通路的异常表达与各种恶性肿瘤和其他疾病有关,如OA。Wnt抑制因子1（WIF1）作为一种重要的拮抗因子,可以与Wnt相关蛋白相结合,结合的场所在细胞外间隙,它们之间的结合会抑制Wnt/β-catenin信号通路的上游。一些研究表明,WIF1在许多人类恶性肿瘤中表达下调,如胶质瘤和星形细胞瘤。此外,前期的研究表明WIF1可抑制Wnt-3a介导的对软骨形成的抑制。因此,第一部分主要研究WIF1在人正常软骨细胞和OA软骨细胞中的表达情况。目前的观点一致认为,骨关节炎发生在所有关节组织中,如半月板、软骨下骨、关节周围肌肉和滑膜,所有这些组织中都存在炎性因子。已经有相关研究表明OA与软骨细胞肥大与钙化的软骨损伤有关,软骨的钙化促进软骨的退行性变。近期研究表明,OA的进展与氧化应激及活性氧（reactive oxygen species,ROS）密切相关。在正常的软骨细胞中,中等水平的ROS作为不可或缺的第二信使参与许多正常的生理过程。但是,在OA的病理情况下,软骨细胞内过量的ROS通过某种机制触发细胞氧化损伤,氧化细胞脂质、蛋白质、碳水化合物和DNAs,从而诱导细胞凋亡。在关节软骨细胞中,ROS作为多种信号通路的信号中间体,包括由细胞因子、生长因子和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白启动的信号通路。软骨细胞内ROS产生和细胞内抗氧化剂的水平保持在一个相对平衡状态,其中细胞的氧化还原状态决定了细胞对细胞因子和生长因子的反应。这种平衡微妙地受到外源性因素的调节,如氧含量或细胞因子。在病理情况下,氧化还原状态可以改变,细胞对生化因子的反应可以完全改变。OA细胞分泌的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）会降解软骨和ECM,而软骨和ECM的结构和功能是由软骨细胞,尤其是MMP-1、MMP-3和MMP-13共同作用的。软骨细胞的分解酶能够实现对机械应力的耐受和关节软骨的弹性,而在OA中这些特性是受损的。因为软骨破损后的修复和再生能力很差,所以可以通过增强软骨细胞的增殖,来抑制骨关节炎的发展。因此,软骨细胞的增殖能力是延缓软骨退变的重要因素,并可通过降低ROS水平来增强MMP的分泌。最近的研究表明,ROS、WIF1和Wnt/β-catenin信号通路之间可能存在连锁关系,可导致细胞凋亡。因此,第二部分我们推测WIF1可能调节软骨细胞中ROS的产生和Wnt/β-catenin信号通路。研究方法:10例骨性关节炎患者（男4例,女6例,年龄55-78岁,平均68.5岁）,曾接受透明质酸钠注射。收集10例无骨性关节炎的外伤性膝关节骨折患者的正常软骨标本（男5例,女5例,年龄47-69岁,平均58.2岁）。所有患者均于2015年12月至2016年10月在中国医科大学人民医院接受膝关节置换术。本研究的所有程序均通过中国医科大学人民医院伦理委员会批准。软骨组织碎片洗涤、消化处理。收集分散的细胞,在含有10%胎牛血清中培养,2代后,软骨细胞可用于后续实验。用WIF1 c DNA质粒骨关节炎软骨细胞,采用人白细胞介素1β（IL-1β）,、抗氧化剂乙酰半胱氨酸（NAC）和β-catenin抑制剂XAV-939处理不同分组的软骨细胞。用白细胞介素-1β（IL-1β）处理骨关节炎软骨细胞来模拟炎症情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和western blot检测WIF-1在OA软骨细胞中的表达。MTT法和流式细胞技术检测细胞增殖和凋亡情况。流式细胞技术检测ROS含量,免疫荧光、western blot和荧光素酶报告基因法检测Wnt/β-catenin信号通路活性。Western blot和酶联免疫吸附法（ELISA）检测凋亡相关蛋白的表达和基质金属蛋白酶（MMPs）的分泌情况。结果:1、WIF1在人OA软骨细胞中低表达:IL-1β处理OA软骨细胞来模拟炎症状态。qRT-PCR和Western blot结果显示,人OA软骨细胞WIF1表达明显低于正常软骨细胞（p<0.01）,而IL-1β处理的OA软骨细胞WIF1表达比OA软骨细胞低（p<0.05）,表明WIF1与软骨细胞炎症呈负相关。2、WIF1下调OA软骨细胞ROS水平:与正常软骨细胞相比,OA软骨细胞的DCF荧光强度明显降低,而IL-1β处理的OA软骨细胞的DCF荧光强度甚至高于OA软骨细胞,表明OA软骨细胞中中ROS水平被上调（p<0.01）。然后将IL-1β处理的OA软骨细胞与NAC（1/2/5 m M）孵育12 h,随着NAC浓度的增加,ROS水平逐渐降低,表明NAC对ROS消除的有效性（p<0.001）。转染WIF1 c DNA后,IL-1β处理的OA软骨细胞ROS水平显著降低（p<0.01）,表明WIF1可以抑制ROS的产生。3、WIF1通过抑制ROS的产生促进OA软骨细胞增殖,减少细胞凋亡。用WIF1c DNA转染OA软骨细胞,并观察qRT-PCR结果。结果表明,WIF1 c DNA显著地增强了WIF1的表达（p<0.01）,提示我们在WIF1的过度表达获得成效。然后用细胞实验来检测上调WIF1的效能。MTT检测表明,上调WIF1和NAC（5 m M）均可促进经过IL-1β处理OA软骨细胞的增殖（p<0.01）;流式细胞术结果显示,WIF1和NAC显著降低经过IL-1β处理的OA软骨细胞凋亡率（p<0.01）。Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、PARP、Bax和Bcl-2。凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax的表达显著降低,而转染WIF1 c DNA或NAC处理后,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,说明WIF1或NAC可通过抗凋亡蛋白Bcl-2的增加抑制OA软骨细胞凋亡（p<0.01）。这些结果表明WIF1可以通过减少ROS的产生来保持软骨细胞的活性。4、WIF1阻断了Wnt/β-catenin信号通路,从而减少了MMP的分泌。采用Western blot、免疫荧光和荧光素酶报告基因法检测β-catenin的活性。Western blot结果显示,IL-1β处理的OA软骨细胞与OA软骨细胞（阴性对照）相比,细胞核和总β-catenin表达增强,胞质β-catenin表达降低;然而,过表达WIF1或存在β-catenin抑制剂XAV-939则显示相反的结果（p<0.01）。免疫荧光显示相似的结果,IL-1β+WIF1和IL-1β+XAV939 OA软骨细胞组β-catenin荧光强度明显低于IL-1β组（p<0.05）。荧光素酶报告基因检测证实,IL-1β刺激可增强β-catenin的转录活性,而WIF1和XAV-939可显著降低β-catenin的转录活性（p<0.01）。此外,检测细胞培养上清中MMP-1、MMP-3和MMP-13的分泌情况。通过WIF1和XAV-939处理的OA软骨细胞MMP-1、MMP-3和MMP-13的分泌均受到显著抑制（p<0.01）。结论:1、WIF1在人OA软骨细胞中低表达;2、WIF1下调OA软骨细胞ROS水平;3、WIF1通过抑制ROS的产生促进OA软骨细胞增殖,减少细胞凋亡;4、WIF1阻断了Wnt/β-catenin信号通路,从而减少了MMP的分泌。