第一部分Epstein-Barr病毒在儿系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中的表达研究[研究背景及目的]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种T细胞依赖的、免疫复合物介导的累及多系统的自身免疫性疾病,可使包括心、肝、肾等多个器官以及神经、血液等多个系统受累,严重影响人类健康。儿童SLE可见于儿童的各个年龄时期,但很少5岁以前发病,青春期增多,新生儿亦可见。儿童SLE的发病机理、临床特点、实验室检查结果与成人SLE类似,但两者仍有显著的差异,儿童SLE临床表现更不典型,首发症状各异,易发生误诊,有潜在的致命性,如不及时治疗,预后远比成人严重。儿童SLE的病因尚不清楚,可能是遗传、性激素、病毒感染等环境因素的共同作用下,自身组织细胞发生或免疫活性细胞发生改变,从而失去自身耐受性,造成机体免疫调节失常。近年来研究发现EBV(Epstein-Barr virus, EBV)可能是与SLE发病关系较为密切的感染因素之一。EBV最先从非洲儿童恶性淋巴瘤体中被发现,属于Y亚科疱疹病毒。EBV具有嗜B淋巴细胞性,急性感染后可引起短暂B淋巴细胞克隆增殖,在免疫功能正常个体,这种B淋巴细胞增殖反应可很快被T淋巴细胞包括细胞毒性CD8+T细胞抑制,终生保持EBV潜伏感染状态。SLE患者存在严重免疫功能紊乱,不能完全像健康正常者一样有效控制EBV潜伏感染,SLE遗传易感者或SLE患者感染EBV后,EBV将作为一个持续存在的威胁因素,最终导致某些病理状况的发生。EBV基因组带有84个开放的阅读框,编码60种病毒蛋白。EBV基因按病毒表达的时期分为4期：潜伏期、即刻早期、早期和晚期结构基因。潜伏基因包括核抗原(EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C和EBNA-LP)、潜伏期膜蛋白家族(LMP1、LMP2A和LMP2B)、EBV编码的RNA(EBER1和EBER2)。即刻早期基因是潜伏基因被激活后最早表达的一种病毒蛋白,属于转录因子家族,包括BZLF1和BRLF1等,能启动其他EBV活化相关基因的转录、翻译和表达。早期基因有BMLF1、BHRF1、BMRF1、BALF5和BARF1等,是与复制病毒基因组的相关酶有关,包括编码解旋酶、引物酶和DNA聚合酶等相应基因。晚期结构基因包括BCRF1、BLLF1等,包括编码结构蛋白的糖蛋白(gp350、 gp85、gp110)的基因和编码衣壳蛋白的基因。EBV在体内存在两种感染状态：裂解型感染及潜伏型感染。国内外大量的研究表明EBV与SLE的关系密切：1、SLE中EBV血清学异常：国内外大量的研究表明SLE患者中EBV血清学阳性率及EBV活化的早期抗原-D抗体、EBV-EA抗体、VCA-IgG抗体等阳性率等均显著高于健康对照组；2、SLE患者EBV病毒载量明显异常：SLE患者血液中EB病毒的载量明显高于正常人群,说明在SLE患者体内EB病毒处于失控状态；3、SLE患者EBV-DNA异常。国内大量的研究均表明SLE患者EBV-DNA有着较高的阳性率；4、SLE患者EBV基因表达的异常。Brian D. Poole等人发现SLE患者外周血单个核细胞EBV潜伏期基因LMP-1及裂解期基因BLLF1, BcRF1表达均显著增加。提示SLE患者中EBV基因表达异常,EBV可能参与了SLE的发病过程。近年来的研究表明EBV可通过分子模拟、分子功能模拟、T淋巴细胞免疫反应、细胞因子旁路机制、表观遗传等多种方式参与SLE发病。既往研究多是以成人SLE为研究对象,而EBV原发性感染多发生于儿童时期,因此分析儿童SLE与EBV感染之间的相关性可能更有助于探索两者之间关系。根据上述研究基础,并进一步研究EBV与儿童SLE相关性,本实验探讨儿童SLE患者与健康对照组外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC) EBV潜伏期基因及裂解期基因的表达情况,以及予以EBV感染后的两组PBMC EBV潜伏期基因及裂解期基因表达情况,试图探讨EBV基因在儿童SLE中的表达情况及可能致病作用,为SLE的致病机理及临床治疗提供新的思路。[方法]1.分离外周血单核细胞和提取DNA：抽取SLE患儿及健康对照组肝素抗凝静脉血30m1。用淋巴细胞分离液常规分离PBMC,提取其中15m1静脉血分离出的PBMC的DNA。2. B95.8 EBV株与1×106/mlPBMC按1：1共同培养12天后,用Trizol(?)试剂盒提取总RNA。3.实时荧光定量PCR法(Real-time fluorescence quantitative PCR, q-PCR)检测PBMCEBV DNA拷贝数。4.实时定量逆转录PCR法(Reverse transcription PCR, RT-PCR)检测EBV相关基因：EBV核抗原1(EBNA1),潜伏膜蛋白1(LMP1),潜伏膜蛋白2(LMP2),即刻裂解基因(BZLF1),晚期裂解基因(BcRF1),晚期裂解基因(BLLF1)。[结果]1、儿童SLE PBMC EBV DNA拷贝数SLE患儿组平均为(658.6±205.7)拷贝/μg,其中活动组(785.2±173.3)拷贝/μg,非活动组(586±193.1)拷贝/μg；而健康对照组(40.1±11.6)拷贝/Lg。经t检验分析,SLE患儿组和健康对照组存在显著性差异(P<0.01),SLE患儿组PBMC EBV DNA拷贝数是健康对照组的10余倍；方差分析表明,活动组、非活动组、对照组在3组间存在显著性差异(P=0.000,F=79.346),两两比较进一步提示SLE患儿组内活动组和非活动组存在显著性差异(P=0.005)。2、儿童SLEPBMC EBV DNA拷贝数与SLEDAI无相关性(r=0.053,P=0.826)。3、儿童SLEPBMC中潜伏期基因和裂解期基因的异常表达实时定量RT-PCR法检测了20例SLE患儿及12例健康对照PBMCEBV基因的表达,发现10例患儿和1例健康对照检测到潜伏期基因LMP1表达,两者有统计学意义差异(p<0.05)。4例患儿和1例对照检测到潜伏期基因LMP2表达,13例患儿和3例对照检测到潜伏期基因EBNA1表达,3例患儿和1例对照检测到裂解期基因BCRF1表达,5例患儿和1例对照检测到裂解期基因BLLF1表达,但均无统计学意义差异(p>0.05)。4、EBV感染后儿童SLEPBMC中潜伏期基因和裂解期基因的异常表达用EBV感染SLE患儿和健康对照PBMC后,RT-PCR检测EBV基因表达,结果发现SLE患儿组潜伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、 BLLF1的表达均显著高于健康对照组,差异有统计学意义(分别为LMP1:1.011±0.141比0.383±0.180, t=10.680, P=0.000; LMP2:1.001±0.093 比 0.208±0.082, t=25.109,P=0.000; EBNA-1:1.012±0.163 比 0.188±0.129, t=14.591, P=0.000; BCRF1:1.015±0.167比0.344±0.161, t=11.268,P=0.000; BLLF1:1.038±0.264比0.117±0.081, t=14.513,P=0.000).[结论]1、儿童SLE患者外周血单个核细胞中EBV DNA拷贝数显著增加,活动期SLE的EBV DNA拷贝数高于非活动期患者,提示SLE患儿体内EBV活跃。2、儿童SLE患者外周血单个核细胞中潜伏期基因LMP1表达显著异常。3、EBV培养后儿童SLE患者外周血单个核细胞中潜伏期基因LMP1、LMP2、 EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1表达异常。4、儿童SLE患者外周血单个核细胞EBV基因的表达异常,EBV基因可能参与了SLE的发病过程。第二部分Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP-1)在儿童狼疮性肾炎肾脏中表达的研究[研究背景及目的]当SLE患儿出现蛋白尿、血尿、红细胞管型、白细胞管型等尿沉渣多样改变,以及水肿、高血压(排除其他因素引起)和(或)肾功能异常等肾实质损害表现时,即可诊断为狼疮性肾炎(Lupus Nephritis,LN)。SLE患儿LN发生率较高,并且随着SLE病程的延长,儿童SLE发生LN的机会逐年增加。多数报道儿童SLE初诊时约50%左右伴有LN,起病2年内达70%～80%,4年后可超过90%。如作肾活检,则几乎100%的患儿均有不同程度的肾脏病理改变。根据2003年国际肾脏病学会和肾脏病理学会联合制定的国际标准(ISN/RPS分型),LN可分为：Ⅰ型(轻微系膜型LN)、Ⅱ型(系膜增生性LN)、Ⅲ型(局灶性LN)、Ⅳ型(弥漫性LN)、V型(膜性LN)及Ⅵ型(终末硬化性LN)。LN的病因及发病机制尚不十分清楚,研究认为包括以下可能机制：(1)循环免疫复合物在肾脏组织的沉积。(2)原位免疫复合物的形成。(3)自身抗体对肾脏的直接损害作用。(4)激活局部补体,产生自细胞趋化因子,造成局部炎症损害,此外还可形成膜攻击复合物直接攻击基底膜,造成肾小球和毛细血管通透性增加,造成肾脏损伤。(5)T细胞介导的免疫反应,参与调节B细胞分泌自身抗体,引起肾脏损伤。(6)其他因素如激肽缓激肽系统,单核细胞、巨噬细胞等在LN中也起到一定作用。国外的研究表明,LMP-1能够通过多种机制加重SLE的自身反应性,包括直接激活B细胞,增强B细胞活化的协同刺激信号,刺激B细胞活化因子(BAFF)的产生,能够协助打破自我耐受等。LMP-1可与CD40L结合,在细胞膜上募集肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosiS factor receptor associated factor, TRAF)家族成员,激活信号传导途径,使EBV异常克隆增殖,并诱导B淋巴细胞大量活化。Bishop等人试验证明LMP-1可活化具有遗传素质的个体的B淋巴细胞,产生大量自身抗体,并导致肾脏损害。LMP-1诱导B淋巴细胞活化过程中肿瘤坏死因子受体结合因子-6(TRAF-6)起到重要作用。LMP-1可直接激活凋亡蛋白Bcl-2的表达,也可通过一些信号传导途径上调受感染B淋巴细胞中bcl-2的表达,抑制B细胞凋亡,促进B细胞存活,使自身抗体不断产生,导致SLE的发生发展。EBV抗原、EBV基因组和病毒抗原的血清学的研究均表明EBV参与了SLE的发病,第一部分研究发现EBV-LMP1基因在SLE发病中有重要作用,但LMP1在是否参与了LN的发病机理尚不清楚。本实验选用儿童LN患者作为研究对象,研究LN患儿临床症状、肾脏病理分级和抗体表达与LMP1的相关性,试图探讨LMP-1与儿童LN的发病的相关性。[方法]实验组来源于海南省妇幼保健院皮肤科与中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科,收取了自2009年1月1日至2013年11月收治的狼疮性肾炎患儿51例,收集患者完整的临床资料。免疫组化方法检测LN及正常对照组肾脏组织中LMP-1的表达,并与患者的临床状态、肾脏病理分级、临床症状及抗体表达进行相关性分析。[结果]1.免疫组化检测LN患儿肾脏组织中LMP-1的表达51例LN患儿和12例健康对照肾脏组织中检测LMP-1蛋白的表达,发现40例(78.4%)LN患儿和2例(16.7%)健康对照表达呈阳性,LN患儿肾脏的LMP-1表达的阳性率与健康对照相比,差异有统计学意义(P=0.000)。2.LN患者LMP-1的表达和不同的临床状态的关系LMP-1的表达与LN的病程无相关性。为了研究LMP-1的阳性率与临床症状的关系,我们检测了初发和复发LN患者的肾脏组织。15例初发患者中,有12例(80%)LMP-1表达阳性,36例复发患者中,有28例(77.8%)LMP-1表达阳性,初发和复发LN患者LMP-1表达无显著性差异(P=1.000)。我们进一步检测了合并细菌感染和未合细菌并感染的LN患儿的LMP1表达,发现20例未合并感染的LN患儿中有16例(80%)患儿LMP1表达阳性,而31例合并感染的LN患儿中有有24例(77.4%)患儿LMP1表达阳性。未合并感染和合并感染的LN患儿的肾脏组织LMP1表达阳性率无显著性差异(P=1.000)。3.LN患者LMP-1的表达和肾脏病理分级的相关性为了研究LN的分级与EBV感染是否有关系,我们检测了肾脏不同病理分级LN患儿的LMP1阳性率。Ⅱ型LN患儿LMP1阳性率为57.1%,Ⅲ型LN患儿LMP1阳性率为66.7%,Ⅳ型和Ⅲ+Ⅴ型LN患儿LMP1阳性率为分别80%和83.3%,Ⅳ+V型LN患儿LMP1阳性率为91.7%,是所有类型中阳性率最高的。LN患者LMP-1的表达和肾脏病理分级的Spearman相关分析表明,二者Spearman相关系数=1,P<0.01,提示LMP1阳性率与LN的分级可能有正相关性,EBV感染可能参与了LN的发病机理。4 LN患者LMP-1的表达和临床症状的关系我们也研究了LN患儿肾脏组织中LMP1阳性率与不同的临床症状的关系。40例LMP1阳性和11例LMP1阴性的LN患儿的贫血、高凝状态、低蛋白血症、低补体血症、血尿+蛋白尿的临床表现无显著性差异(P>0.05)。然而,LMP1阳性LN患儿与LMP1阴性LN患儿比较,肾功能不全、血尿、蛋白尿的发生率显著性升高(P<0.05)。5.LN患者LMP-1的表达和自身抗体的关系我们研究了自身抗体与LN患儿LMP-1的相关性,这些结果提示,LMP1阳性LN患儿与LMP1阴性LN患儿比较,只有anti-Sm抗体的阳性率在LMP1阳性LN患儿中显著升高(P=0.009), ANA, anti-RNP, anti-Jo-1, anti-dsDNA, anti-SSA and anti-SSB抗体在两组间无显著性差异(P>0.05)。[结论]1、LMP-1与LN发病相关,但与病毒感染状态无关。2、LMP-1与LN患儿肾脏损害程度和类型呈阳性相关,EBV感染可能提高LN的肾脏分级。3、LMP-1阳性LN患者的肾功能不全、血尿、蛋白尿临床症状出现的阳性率更高。这些结果提示LN患儿的临床症状与LMP-1的表达呈阳性相关,EBV感染可能加重LN的临床表现。4、EBV感染可能通过增加Anti-Sm抗体的产生而成为LN病情加重的因素。第三部分Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1在儿童狼疮性肾炎患者中表达的比较[研究背景及目的]通过实时定量逆转录PCR (RT-PCR)、肾脏免疫组化和ELISA3种方法研究儿童狼疮性肾炎(LN)中EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)的表达,试图探讨LMP-1在儿童LN的致病机制。[方法]41例LN患儿和12例健康对照组,分别用RT-PCR法、免疫组化方法、ELISA法检测两组外周血单核细胞(PBMCs)、肾脏组织及血清中LMP-1的表达。[结果]① RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测LN患儿和健康对照者的阳性率分别为(65.9% vs 8.3%,95.1% vs 16.7%,22.0% vs 8.3%),差异有统计学意义(P<0.05)；②3种方法检测LMP-1的表达,免疫组化检测阳性率高于其它两组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]儿童LN中存在EBV潜伏期基因LMP-1表达异常,其中肾脏组织中表达阳性率最高,提示LMP-1可能参与了儿童LN的发病。