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K-RAS蛋白属于RAS蛋白家族中的一员,当EGFR或其他酪氨酸激酶受体在胞外信号分子刺激下激活后,RAS蛋白从与GDP结合的无活性形式转变成与GTP结合的有活性形式,继续激活RAF-MAPK及PI3K/AKT等信号通路,最终实现对细胞增殖、凋亡、代谢及血管生成的调节。突变的RAS基因导致RAS蛋白的GTP酶活性降低,使其处于与GTP结合的持续激活状态,从而使正常细胞发生恶性转化成并形成肿瘤。KRAS基因是结直肠癌中突变频率最高的基因,其不同的突变类型与结直肠癌的分期及预后相关。此外,KRAS突变与转移性结直肠癌治疗中抗表皮生长因子受体单克隆抗体(anti-EGFR mAb)的耐药性相关,然而其具体机制尚不明确。最近临床研究发现并非所有KRAS突变类型的生物学效应都相似,与第12密码子各种突变不同,G13D突变的转移性结直肠癌患者仍能从抗EGFR单抗的治疗中获益。该结果仍需体内外实验的进一步验证,并探究其发生机制。为了进一步研究KRAS基因上述突变在结直肠癌预后及治疗中的作用,构建稳定表达这些突变的结直肠癌细胞株成为首要任务。本研究通过构建野生型及G12D. G12V、G12A、G12S, G13D和Q61H共6种突变型KRAS重组慢病毒载体,并包装沉淀成慢病毒颗粒感染结肠癌细胞株CACO-2.经Pull down、Western blot实验及cDNA测序,证实感染后细胞稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因。为进一步研究KRAS基因不同突变的生物学特性奠定了基础。实验目的：构建野生型及6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体,并包装沉淀慢病毒颗粒,感染结肠癌细胞株CACO-2,采用Pull down、Western blot实验及cDNA测序鉴定稳定转染细胞系。从而为下一步研究KRAS基因不同突变在结直肠癌治疗及预后中的作用提供重要的工具。实验方法：1通过RT-PCR从人结肠癌细胞株CACO-2中扩增野生型KRAS基因,并将该基因连接到慢病毒表达载体。2.以野生型KRAS基因为模板,利用定点突变PCR技术构建G12D、G12V、G12A、G12S, G13D和Q61H共6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体。3.经293T细胞包装沉淀慢病毒颗粒及滴度测定后,感染人结肠癌细胞株CACO-2,成功构建稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因的细胞株。通过cDNA测序证实突变KRAS基因的表达,并根据突变型KRAS蛋白的持续激活状态经Pull down及Western blot实验证实其蛋白表达。实验结果：经测序鉴定成功构建野生型KRAS基因重组慢病毒表达载体pCDF-KRAS-WT,通过定点突变PCR技术成功构建pCDF-KRAS-G12D、 pCDF-KRAS-G12V、pCDF-KRAS-G12A、pCDF-KRAS-G12S、pCDF-KRAS-G13D、 pCDF-KRAS-G61H共6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体。病毒载体包装沉淀成病毒颗粒感染CACO-2细胞后,经Pull down及Western blot实验及cDNA测序证实感染后的细胞株CACO-2-WT、CACO-2-G12D、CACO-2-G12V、 CACO-2-G12A、CACO-2-G12S、CACO-2-G13D、CACO-2-G61H稳定表达野生型及上述6种突变型KRAS基因。实验结论：成功构建了野生型及6种突变型KRAS基因重组慢病毒载体,包装沉淀成慢病毒颗粒并测定滴度后感染结肠癌细胞CACO-2,经鉴定成功构建稳定表达野生型及6种突变型KRAS基因的CACO-2细胞株。为进一步研究KRAS突变的在结直肠癌中的生物学特性提供了实验工具。