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目的:肺炎支原体(mycoplasma pneumonia,MP)是引起小儿呼吸道感染的常见病原体之一。MP感染除引发呼吸系统炎症外,还几乎可以累及人体其他全部器官。神经系统侵害是MP所导致肺外疾病中常见的类型之一。脑炎是MP感染累及中枢神经系统的表现中最为常见的一种[1]。目前,对于儿童罹患肺炎支原体脑炎(Mycoplasma pneumoniae encephalitis,MPIE)的诊断尚没有明确标准,治疗也有很多争议。目前MP感染的检测方法包括脑脊液(cerbrospinal fluid,CSF)PCR、脑脊液病原体的培养、血清特异性Ig M和Ig G抗体测定等方法。血清抗体检测虽方便易行,但仅抗体阳性不能确诊,只能作为疑似病例。PCR和病原体培养可以作为确诊MPIE的金标准,但两种方法都存在着阳性率极低的缺点。对于那些有脑炎症状而金标准检测阴性的患者如何确诊,是临床诊断中的难题,急需找到敏感可行的检测手段,提高检出率,确定病因,辅助治疗。由于实验技术手段的日益成熟,传统的PCR技术已经无法满足需求,由此而诞生的多重PCR(multiplex PCR)是在同一个PCR反应体系中加上两对或更多对的引物,并能同时扩增出相应多个核酸片段的PCR反应。而GeXP多重RT-PCR(GeXP m RT-PCR)即为此原理。本研究预利用此方法诊断肺炎支原体脑炎,并与传统的PCR法进行比较,分析GeXP多重RT-PCR在诊断肺炎支原体脑炎中的敏感性。方法:1资料收集:2015年5月至2016年8月河北省儿童医院神经内科病区收治的,初次入院的患儿100例(年龄32日-10岁,男女比例51:49),以发热伴头痛为首发症状,有嗜睡,萎靡,呕吐症状,后继出现神经系统症状和体征的疑似脑炎的患儿,每位患儿在入院第一日或第二日采集1份脑脊液,1份静脉血。2指标检测:对采集的100份疑似脑炎患者的脑脊液进行病原体筛查。(1)对所有标本进行常规脑脊液细菌培养,培养阳性的标本可确诊细菌感染性脑炎。(2)排除常见细菌性脑炎的剩余标本进行脑脊液抗酸染色检查,抗酸阳性的标本可确诊结核性脑膜炎。(3)还未确诊的标本进行脑脊液行普通涂片染色检查,检测新型隐球菌在内的微生物,排除其他微生物感染所致脑炎。(4)细菌检测阴性的标本进行病毒学检测:GeXP多重RT-PCR法设计有甲型流感病毒等多种病毒引物(见表-1),排除病毒性脑炎的病例。同时亦进行EBV血清Ig M抗体检测与脑脊液EBV DNA检测。(5)对以上检测全部阴性的标本进行支原体检测。首先采用被动颗粒凝集法进行血清中的肺炎支原体Ig M检测,筛查出血清抗体阳性的疑似支原体脑炎患者,再对该病人的脑脊液分别采用GeXP多重RT-PCR和普通PCR法检测,并对比分析检测结果,探寻检测支原体感染性脑炎的敏感方法。(6)对所有标本进行脑脊液生化检查(项目包括脑脊液葡萄糖含量测定、脑脊液蛋白含量测定、脑脊液氯离子含量测定、脑脊液腺苷脱氨酶测定,其中葡萄糖和蛋白质含量作为主要参考指标)、脑脊液细胞学常规检查,综合上述检测结果,作出最后的病原学诊断。(7)最后测定的肺炎支原体阳性标本,进一步DNA测序鉴定。3分析的指标:(1)GeXP多重RT-PCR检测法:标本最终经过毛细管电泳呈现图形显示,肺炎支原体阳性结果中除3个内参峰,在核酸片段大小为216.8nt处出现特异的MP阳性峰。(2)抗体颗粒凝集法结果显示为(+++)时为阳性,显示(-),(+),(++)时均为阴性。(3)对两方法实验结果综合患者各项临床指标和脑脊液实验室检查结果,最后确诊是否为肺炎支原体脑炎,并比较检出率差异。4统计分析:采用配对资料χ2检验查验阳性率有无差异,检验水准α=0.05。结果:1细菌学检测结果:大肠埃希菌阳性1例,肺炎克雷伯菌阳性1例,金黄色葡萄球菌阳性2例,表皮葡萄球菌阳性1例,人葡萄球菌阳性2例,肺炎链球菌阳性7例,结核分支杆菌阳性4例,白色念珠菌阳性2例(见表-2)。细菌性脑炎合计18例,真菌性脑炎2例。2病毒学检测结果:排除上述病原体检测阳性标本20例后,尚未确诊的80例标本进行EBV检测:结果显示EBV Ig M抗体和脑脊液EBV DNA均为阳性的标本共2例(见表-3)。3经上述检测后,尚剩余78例标本未确诊,进行支原体检测:采集的血清经抗体颗粒凝集法检测,19例血清支原体Ig M阳性,视为可疑支原体脑炎病例。随后将19例可疑脑脊液标本经GeXP多重RT-PCR分析系统检测,得到8例阳性标本,阳性率为42%。而普通PCR法仅测出2例阳性结果。经x2检验,P<0.05,两种检测结果存在统计学差异,GeXP多重RT-PCR法优于普通PCR法(见表-4)。4最后检测得到的8例阳性标本,由于两种PCR结果不一致,故而将PCR产物送生物公司测序检测,结果证明这8例均为肺炎支原体阳性结果(见附图2)。结论:1 GeXP多重RT-PCR法在检测脑脊液肺炎支原体时优于传统的PCR法;并可同时排除其他病毒感染。2 GeXP多重RT-PCR检测法在检测小儿肺炎支原体方面具有高准确性,高灵敏度,特异性强且高效等明显优势,对临床医生快速准确的诊断肺炎支原体脑炎具有很高的应用价值,为肺炎支原体脑炎的早期诊断,早期治疗提供了实验室诊断依据。