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人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)为从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子,它能显著提高CCL<,4>致肝功能衰竭大鼠的存活率.进一步的研究发现其具有刺激肝细胞DNA合成、抑制肝脏自然杀伤细胞(n atural killer cell,NK)、诱导肝线粒体基因表达、参与肝再生、氧化游离巯基以及参与细胞质铁硫蛋白(Fe/S proteins)合成等多种生物学作用.该蛋白最为人们所重视的是其对急慢性肝损伤的保护作用,因此开展人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,rhALR)的研究将推动肝再生机制的理论发展,最终用之于重症肝病的临床救治.该课题鉴定并证明了hALR与Na<+>,K<+>-ATPase之间存在直接的相互作用,并围绕hALR的结构与Na<+>,K<+>-ATPase的结合功能展开研究.首先将Na<+>,K<+>-ATPase基因片段定向克隆到pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得受体基因和GST(glutathione S-transferase)的融合表达.表达的融合蛋白经谷胱甘肽偶联的琼脂糖珠纯化,以GST pull-down实验测其与hAlr蛋白的体外直接相互作用.结果表明,Na<+>,K<+>-ATPase蛋白可在体外与hAlr蛋白特异地结合,hALR和Na<+>,K<+>-ATPase存在直接的相互作用.此外,根据hALR空间结构—α螺旋锥形束的结构,利用定点突变及PCR的方法构建hALR突变体及其缺失体,并利用酵母双杂交分析hALR突变体/其缺失体与Na<+>,K<+>-ATPase结合活性变化.酵母双杂交结果表明,(1)参与组成hALR锥形结构N—末端无规卷曲的1~13位氨在酸残基对于hALR的Na<+>,K<+>-ATPase结合活性并不是必需的.(2)参与组成hALR锥形结构中α1与α2螺旋的14~48位氨基酸残基对于ALR的Na<+>,K<+>-ATPase结合活性是必需的,如果缺失这一段序列,会使其结合活性完全丧失.(3)如不改变参与组成hALR锥形结构的氨基酸残基,对其他的氨基酸残基的定点突变对于hALR的Na<+>,K<+>-ATPase结合活性影响不大,hALR发挥Na<+>,K<+>-ATPase结合活性需要完整的hALR锥形空间结构.