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目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’ sdisease, AD)是目前老龄化社会面临的紧迫问题,尚无有效的治疗方法。最近研究证实,线粒体损伤诱发的细胞凋亡参与了阿尔茨海默病的发病过程,因此,受损线粒体的及时清除是非常重要的。线粒体自噬是细胞有选择性地清除功能异常或受损的线粒体的过程,是近年研究的热点。本实验应用APPsw/PS1dE9双转基因小鼠作为AD的动物模型,动态观察不同月龄AD小鼠的行为学、线粒体形态、自噬及线粒体自噬指标的变化。以体外培养的稳定转染APPsw的HEK293细胞(20E2细胞)作为AD的细胞模型,观察其线粒体形态、自噬和线粒体自噬指标的变化。从而探讨AD动物及细胞模型中线粒体形态、线粒体自噬的改变。方法：1.采用以C57BL/6小鼠为遗传背景的APPsw/PS1dE9双转基因小鼠作为AD的动物模型,分别于3月龄、6月龄、9月龄和12月龄时处死小鼠,对照组为8-9月龄C57BL/6小鼠(均为雄性,每组15只)。体外培养的稳定转染APPsw的HEK293细胞(20E2细胞)作为AD的细胞模型,对照组为HEK293细胞。2.用Morris水迷宫检测小鼠行为学。检测过程共7天。第1天没有平台,为小鼠的适应期。第2-6天为小鼠的学习期,水迷宫中放入平台,平台隐藏在水面下0.5-1cm,位置SW (southwest),每只小鼠每日学习4次,入水点分别为E(east)、N(north)、NW(northwest)SE(southeast),次序随机,每次时间共60s,如果小鼠在以上规定找到平台,则在平台上停留15s以便记住平台位置。若小鼠在规定的60s时间内没找到平台,则引导小鼠上台,并维持小鼠在台上停留15s。记录小鼠找平台所需的时间(逃避潜伏期),此过程共5天。第7天为小鼠的探索期,是学习实验结束大于24小时后,撤掉平台,将小鼠于NE (northeast)方向入水,记录时间为60s,记录小鼠停留在原平台所在象限的时间和穿过原平台所在位置的次数。以潜伏期、目标象限所在时间、穿越平台次数等指标来评定小鼠的学习和记忆能力。所得到的数据使用方差分析和LSD的事后分析方法。3. 用透射电子显微镜观察小鼠海马CA3区部位的线粒体形态；观察20E2细胞、HEK293细胞的线粒体形态,确定AD动物及细胞模型中线粒体形态的改变。4. 采用Western blot半定量的方法检测小鼠海马组织和细胞内与自噬相关的蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62的含量,确定AD动物和细胞模型中自噬的变化。5. 采用免疫印迹Western blot半定量的方法检测小鼠海马及细胞内线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的含量,确定AD动物和细胞模型中线粒体自噬的变化。结果：1.6月龄及以上月龄的APP/PS1小鼠表现明显行为学改变。在学习能力上,自6月龄开始,APP/PS1小鼠的逃避潜伏期长于对照组,且随月龄增加,潜伏期也随之增加。在记忆能力上,6月龄及以上月龄的APP/PS1双转基因小鼠目标象限所在时间、穿越平台次数均比对照组C57小鼠增加,且随月龄增加改变愈加明显。提示6月龄及以上月龄的APP/PS1双转基因小鼠学习和记忆能力出现明显下降,且随月龄增加逐渐明显。2. APP/PS1双转基因小鼠脑组织和20E2细胞电镜下可见线粒体形态学异常。正常C57小鼠海马区线粒体双层膜结构完整,线粒体嵴清晰。相比较C57小鼠,3月龄APP/PS1小鼠海马线粒体大多结构完整,部分线粒体表现体积增大、基质疏松、嵴排列紊乱,伴吞噬了线粒体的自噬泡形成。6月龄APP/PS1小鼠中结构异常的线粒体进一步增多。9月龄APP/PS1小鼠海马内可见大量损伤、退化的线粒体,表现双层膜结构溶解,内嵴破坏,甚至有大量退化的线粒体固缩、基质变深,在轴突中堆积形成髓样小体。12月龄APP/PS1小鼠海马脑内可见大量自噬泡及髓样小体形成。相比较对照组HEK293细胞,20E2细胞中可观察到明显的线粒体嵴消失、线粒体肿胀、空泡化等改变。提示在AD动物及细胞模型中线粒体形态发生改变。并且这种形态学改变在小鼠出现明显认知功能障碍症状之前即可观察到。3.6月龄及以上月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑组织和20E2细胞自噬标记物上调。Western blot结果提示,与对照组相比,6月龄及以上月龄APP/PS1小鼠海马组织和20E2细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加,p62表达减少,且含量随月龄变化不明显。说明6月龄及以上月龄APP/PS1双转基因小鼠和20E2细胞中自噬是增加的。4. APP/PS1双转基因小鼠脑组织和20E2细胞线粒体自噬标记物上调。Western blot结果提示,与对照组相比,APP/PS1小鼠海马组织和20E2细胞中线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin表达增加,且表达量在各月龄亚组之间无明显差异。提示在AD动物及细胞模型中,通过PINKl/Parkin途径介导的线粒体自噬是增强的。并且在动物实验中,痴呆小鼠出现明显认知功能障碍症状之前,已表现出线粒体自噬的上调。结论：综上,我们在实验中观察了不同月龄的APP/PS1双转基因小鼠与正常对照C57小鼠的行为学、脑组织线粒体形态及自噬和线粒体自噬相关指标的动态变化,以及体外培养的HEK293细胞和20E2细胞中线粒体形态及自噬和线粒体自噬相关指标的变化,证实了APP/PS1双转基因小鼠脑组织及20E2细胞在电镜下线粒体形态学改变明显,自噬相关蛋白.C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加,p62表达减少,线粒体自噬相关蛋白PINK1、PARKIN表达增加。据此我们认为,在AD动物及细胞模型中,PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬增强,对神经元起保护作用。线粒体形态学异常和线粒体自噬的上调在AD动物出现明显认知功能障碍症状之前即已发生,为AD的早期事件。