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背景：肝癌细胞淋巴道转移和耐药性是影响肝癌患者预后和生存的重要因素，其相应机制的研究可为其临床诊断和治疗提供依据。膜联蛋白A11（AnnexinA11，Anxa11）为膜联蛋白家族成员之一，是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。研究表明Anxa11表达失调与肿瘤的恶性转变、耐药性及转移等密切相关，但具体作用机制不清。本课题组前期采用Western blot对来源于同一亲本、遗传背景相同但淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-P（淋巴结转移率约25%）和Hca-F（淋巴结转移率约75%）的研究发现，Anxa11在Hca-P的表达约为其在Hca-F中的2倍（P<0.01），提示Anxa11可能是潜在的抑制小鼠肝癌淋巴道转移的蛋白。目的：1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表达载体，稳定转染至Hca-P，筛选获得Anxa11表达稳定下调的Hca-P单克隆细胞株；2、研究Anxa11下调对Hca-P体外凋亡、迁移、侵袭、粘附及耐药性的影响；3、探究Anxa11下调对Hca-P体内淋巴结转移能力的影响；4、探讨Anxa11下调对Hca-P中转录分子c-Jun蛋白以及其磷酸化水平在药物作用前后的变化。方法：1、按Anxa11的mRNA序列，设计Anxa11的shRNAs以及无关序列作为阴性对照；2、构建含干扰序列的pGPU6/GFP/Neo表达载体，利用限制性内切酶酶切鉴定和序列测定验证构建载体的正确性；3、利用梭华-Sofast转染试剂，将构建好的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表达载体及无关序列表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-negative control分别转染至Hca-P细胞，采用G418筛选及有限稀释法获得相应的单克隆细胞株，采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot检测Anxa11表达稳定下调的单克隆细胞株；4、Transwell小室法和淋巴结原位杂交法检测Anxa11下调对Hca-P细胞体外迁移、侵袭和粘附能力的影响；5、小鼠足垫皮下注射法分析Anxa11下调后Hca-P细胞淋巴结转移情况；6、Westernblot分析Anxa11下调对Hca-P中相关凋亡分子表达影响；7、CCK-8法及Hoechst33258试剂盒检测Anxa11下调对Hca-P细胞耐药性及抗5-FU诱导凋亡的影响；8、Western blot检测Anxa11下调对Hca-P细胞在不同浓度5-FU作用后c-Jun的表达变化和磷酸化水平。结果：1、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11和negative control表达载体构建成功；2、筛选获得Anxa11表达稳定下调的单克隆细胞株P-1，与无关序列单克隆细胞株P-nc相比，Anxa11在mRNA和蛋白水平分别下调82.49%和80.53%；3、相比P-nc细胞，P-1细胞的体外迁移、侵袭和淋巴结粘附能力分别提高了约1.55、1.20和1.13（1.35）倍；4、P-1细胞体内淋巴结转移能力明显高于P-nc细胞；5、Anxa11下调对Hca-P细胞凋亡没有显著性影响，但促进Hca-P细胞中Bax和Bcl-2表达；6、与P-nc细胞比较，P-1细胞对5-氟尿嘧啶（5-FU）有明显的耐药性，但对顺铂（cisplatin）并没有产生明显的耐药性；7、无5-FU作用下，与P-nc细胞比较，P-1细胞中pSer73-c-Jun磷酸化水平升高，而c-Jun蛋白及pSer73-c-Jun磷酸化水平上调为5-FU剂量依赖性。结论：1、成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1、2和negative control重组表达载体；2、筛选获得Anxa11表达稳定下调的单克隆细胞株；3、Anxa11下调促进Hca-P细胞的体外迁移、侵袭和淋巴结粘附能力；4、Anxa11下调促进Hca-P细胞体内淋巴结转移能力；5、Anxa11下调促进Hca-P细胞中Bax和Bcl-2的表达；6、Anxa11下调增强Hca-P细胞对5-FU的耐药性；6、Anxa11下调可通过影响c-Jun表达及其磷酸化形式来调控鼠肝癌细胞淋巴道转移能力及耐药性。