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目的 肿瘤细胞是由正常细胞恶性转化而来，其信号传导机制与正常细胞存在明显区别，其中既有量的差异，更重要的是质的不同。β-连环素／T细胞因子4(T cell factor 4，TCF-4)信号通路，是细胞生长、发育的关键性信号系统，且多与内胚源性器官相关。在大多数的结肠癌和一些胃癌、肝癌中该通路已被证实具有重要作用。β-连环素和TCF-4是该信号通路的两个重要信号分子。β-连环素作为多功能蛋白，一方面同E-钙粘连素结合形成细胞连接；另一方面，入核与TCF-4结合形成复合物，激活Wnt信号通路下游靶基因转录。尽管β-连环素在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)中的表达已有报道，但其与NSCLC的相互关系、作用并未完全了解。而TCF-4作为具有高度保守的高迁移率组蛋白盒(high mobility groupbox，HMG BOX)的TCF家族的主要成员，在肺癌中的研究仅限于几个细胞系。本实验首先通过免疫荧光、免疫组化、RT-PCR技术分别观察β-连环素和TCF-4在NSCLC中的蛋白及mRNA表达，然后通过免疫沉淀和蛋白质杂交检测β-连环素／TCF-4复合体在NSCLC中的表达，初步探讨、分析β-连环素／TCF-4信号通路与NSCLC病理过程的关系。 方法 1 实验材料 60例NSCLC组织，8例癌旁正常组织取自中国医科大学第一附属医院胸外科2001年9月-2003年3月手术标本，均经病理诊断证实。一部分组织经石蜡包埋，用于免疫组织化学研究；一部分组织经组织包埋剂包埋，用于免疫荧光观察；另一部分组织经液氮冷冻后置于-70℃保存，用于RT-PCR和Western blotting分析。 .2实验方法 2.1免疫荧光:冰冻切片固定后，依次滴加p一连环素鼠抗人单克隆抗体，荧光标记二抗，核复染，应用激光共聚焦显微镜观察肺癌组织内卜连环素的蛋白分布。 2 .ZRT一PCR半定量测定:用试剂TRIZOL提取总RNA，一步法反转录、扩增p一连环素和p一actin的mRNA，根据自动凝胶分析系统检测的扩增电泳条带的整合光密度值，检测p一连环素mRNA的相对含量。 2 .3免疫组织化学:石蜡切片，用兔抗人代F4多克隆体、过氧化物酶标记的链酶卵白素(SP)染色试剂盒检测TcF4的蛋白分布和表达，结合显微图像分析软件分析冗F4的蛋白表达强度。 2.4RT一PcR半定量测定:用试剂TRIZOL提取总RNA，一步法反转录、扩增TCF4和p一actin的mRNA，根据自动凝胶分析系统检测的扩增电泳条带的整合光密度值，检测代F4 mnNA的相对含量。 2.5蛋白提取:应用超速离心将组织的细胞核、细胞浆的蛋白分离。 2 .6免疫沉淀和Westem bI0tting:用兔抗人代F4多克隆体和蛋白A将p一连环素/TCF4复合物沉淀，复合物经聚丙稀酞胺电泳分离，最后经化学发光试剂检测。 3结果判定及数据处理 3.1日一连环素的免疫荧光观察:以癌旁正常支气管上皮细胞膜的染色强度为标准，将肿瘤组织染色情况分两类，一类为同一视野内肿瘤细胞染色强度与正常支气管上皮细胞膜的染色强度相同的细胞数大于或等于50%，另一类为小于50%。如果细胞核的轮廓或位置能从蛋白质阳性染色中分辨出来，既判定细胞核表达阳性。 3.Zp一连环素的mRNA表达:p一连环素mRNA的相对含量进行样本均数的t检验。p一连环素的mRNA表达在p一连环素细胞膜高、低表达组间以及在p一连环素细胞核表达有、无组间的样本均数进行t检验。 3.3 TCF4的免疫组织化学观察:根据切片细胞核或细胞浆的阳性细胞数将染色模式分为4类:仅细胞核染色或细胞核染色的细胞数多于细胞浆染色的细胞数，仅细胞浆染色或细胞浆染色的细胞数多于细胞核染色的细胞数，细胞核、细胞浆均染色且染色的细胞数相近，细胞核、细胞浆无染色。各染色模式间进行犷检验。代表细胞染色强度的积分光密度值，进行样本均数的t检验。 3. 4TCF4的mRNA表达:TCF4 mRNA的相对含量进行样本均数的t检验。 3.sp一连环素/TCF4复合体的表达:免疫沉淀后蛋白质经电泳、转膜、化学发光检测，胶片在92KD处有清晰条带，即判定复合体表达。 3 .6各检验的显著差异均设为95%。实验结果 1100%正常肺组织具有p一连环素的细胞膜均一表达，37%NsCLC组织内p一连环素细胞膜表达下降，100%NSCLc组织具有p一连环素细胞浆表达，51%NSCLc组织具有p一连环素细胞核表达。 2正常肺组织内p一连环素mRNA低表达，NSCLC组织内p一连环素mR-NA高表达，且显著高于正常组织(0.28土0.20，0.11土0.08，p<0.01);p-连环素mRNA表达在NSCLC组织分型及组织分化之间无显著差异。p一连环素细胞膜表达低(<50%)的组内p一连环素mRNA表达显著高于p一连环素细胞膜表达高(〕50%)的组(0.43土0.18，0.21土0.08，p<0.01)。p一连环素细胞核表达组的p一连环素mRNA水平与无p一连环素细胞核表达组的p一连环素mRNA水平间无显著差异(0.32土0.19，0.32土0.15，P>0.05)。 3正常组织内无可检测到的TCF4表达，85%NSCLC组织内TCF4表达，且以细胞核表达为主。肺腺、鳞癌内TCF礴染色模式具有显著差异(才二8.gP<0.05);中、低分化肺癌组织的TCF礴表达强度显