粪肠球菌(E.faecalis)是革兰氏阳性致病菌,其血清型为D型,可引起人类的多种疾病,包括败血症,尿路感染,心内膜炎和脑膜炎等,粪肠球菌所致疾病占人体肠道球菌感染的80-90%。粪肠球菌同时也是动物机体内常驻菌,其能在人和动物间水平传播,动物感染死亡的报道也越来越多,主要有仔猪关节炎、鹑鸡败血症、家兔腹泻、羔羊脑炎和牛乳腺炎等。试验旨在通过分离鉴定熊源粪肠球菌,构建粪肠球菌EfaA基因重组表达质粒,并测定其蛋白的免疫原性。本试验采用形态学、生化特性、药敏试验、血清学及分子生物学试验等方法分离鉴定熊致病菌,并应用PCR方法鉴定该菌株致病基因;同时选取EfaA致病基因为目标基因,分子克隆,生物信息学分析;然后构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,并转化至BL21(DE3)感受态细胞中;应用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。然后将纯化后的蛋白接种BALB/c小鼠后测定小鼠血清中抗体效价,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG1、IgG2a、INF-y、IL-4水平。结果表明,经分离、鉴定和NCBI 比对结果表明该致病菌为粪肠球菌,通过PCR方法获得4个致病基因,并成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得表达蛋白约为59 Ku,纯化后获得浓度为3 mg/mL,蛋白纯度>85%,纯化蛋白经Western-blot分析,具有较好的反应原性。接种BALB/c小鼠后,血清中抗体效价达到1:1 024,IgG1和IgG2a特异性抗体水平、IFN-y和IL-4细胞因子水平,在第三次免疫后试验组均极显著高于对照组(P<0.01)。表明本试验纯化的粪肠球菌EfaA蛋白能使小鼠机体产生良好的免疫保护作用。试验成功制备了抗EfaA蛋白的多克隆抗体,为今后研制粪肠球菌EfaA基因的血清学诊断试剂、单克隆抗体及疫苗的研制奠定基础。