microRNA（miRNA）是只含有12～23个核苷酸的小RNA,通过外泌体（Exosome）运输参与转录后基因的表达调控和多种生物进程。鸭坦布苏病（Duck Tembusu disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的以鸭产蛋量下降为主的禽类疾病,但目前未有DTMUV引起的免疫应答及调控的研究。因此,本研究首先筛选了DTMUV触发的免疫通路并对该宿主免疫通路在DTMUV感染过程中的功能进行了研究。然后我们探究了DEF-Exo miR-148a-5p对免疫通路的调控作用。1.DTMUV感染DEF后免疫通路的筛选及免疫通路作用的探究培养DEF细胞,收集感染DTMUV后12h、24h、36h、48h、60h细胞,用qRT-PCR检测IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4转录水平。结果显示DTMUV感染DEF后可引起DEF中IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4的转录水平升高（P<0.05）。将人工合成的TLR3 shRNA和构建的pc DNA3.1（+）-TLR3重组质粒分别转染DEF 24h后再感染DTMUV,通过qRT-PCR检测TLR3下游免疫因子及DTMUV E基因转录水平。结果显示,TLR3下游免疫因子转录水平随TLR3的过表达而升高,随TLR3的沉默表达而降低（P<0.05）,此外TLR3能下调DTMUV E基因的转录水平（P<0.05）。DTMUV感染DEF 36h后,分别加入50 IU/mL、100 IU/mL、250 IU/mL、500 IU/mL禽IFN-β。同时将500 IU/mL禽IFN-β加入接毒后的DEF共培养0h,6h,12h,24h。提取细胞全RNA用qRT-PCR对DTMUV E基因的转录水平进行检测。结果显示,IFN-β在一定范围内和处理时间内可下调DTMUV E基因转录水平。表明DTMUV感染能触发TLR3免疫通路,TLR3免疫通路通过分泌IFN-β下调DTMUV E基因转录水平,影响病毒复制。2 DEF-Exo miR-148a-5p对TLR3调控的探究用外泌体分离试剂分离DEF细胞上清中的外泌体。用电镜和western blot对分离物质进行鉴定。电镜结果显示分离到的物质呈现周边凸起、中心凹陷的杯状结构,囊泡小体直径约80 nm,且western blot检测到外泌体表面标志物TSG101和CD9,表明成功分离到DEF-Exo。将接毒的DEF-Exo和未接毒的DEF-Exo分别与PBMC细胞共培养36h后,用qRT-PCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达进行检测。结果显示未接毒的DEF-Exo能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。生物学软件预测发现miR-148a-5p可靶向TLR3,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-5p与TLR3的靶向关系。结果显示模拟剂（mimic）和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,在mimic和pmir GLO-TLR3-Mut及control和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性没有明显变化（P>0.05）,表明miR-148a-5p可以与TLR3特异性结合。将miR-148a-5p mimic和control分别转染DEF后感染DTMUV,用qRT-PCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达检测。结果显示miR-148a-5p能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。结果表明:DEF-Exo中miR-148a-5p能靶向TLR3并抑制其表达,影响TLR3通路分泌IFN-β而促进DTMUV复制。