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目的神经损伤的不可逆性使得干细胞移植治疗潜在可能越来越受到研究者的关注。而一种稳定、安全、有效的自体细胞来源也显得尤为重要。骨髓间充质干细胞所具有的独特特点包括取材简易、分离纯化以及培养的技术较为成熟、免疫原性较弱,多向分化能力和较强的增殖能力等诸多优点成为近年来组织工程学研究的热点种子细胞。而骨髓中BMSCs的含量有限,向神经样细胞分化的不确定性,分化机制仍需进一步加深等都限制了临床应用。因此本实验通过应用bFGF对BMSCs的生影响,观察其生长过程,研究bFGF在BMSCs增殖过程中所起的作用。并通过对骨髓间充质干细胞诱导分化过程中所产生的神经样细胞进行形态学鉴定及利用免疫细胞化学、RT-PCR等技术检测多种神经细胞特异性标志物的表达,据此探讨bFGF在BMSCs增殖及向神经样细胞诱导过程中的作用,为BMSCs早日能够为临床服务提供一定的实验依据和理论基础。方法采用出生SPF级Wistar大鼠进行无菌骨髓细胞提取分离并培养,使用贴壁筛选分离法纯化出BMSCs,当传至第3代时利用流式细胞仪细胞表面抗原标志物进行检测鉴定,应用免疫细胞化学方法对细胞中CD90,CD71阳性细胞进行鉴定。取第3代(F3)细胞继续进行培养(10%FBS, DMEM/F12),并将该细胞群分为干预组和空白对照组,实验组分别加入不同浓度梯度的bFGF。空白对照组继续使用普通培养基培养。当细胞铺满达到80%时进行消化、传代,培养9天。利用光学显微镜每日观察骨髓间充质干细胞每日的生长情况,拍照并记录BMSCs的生长活性与增殖分化状态。持续观察8天后,使用免疫细胞化学染色方法检测特异性神经细胞标志物如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)等；应用RT-PCR方法对细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)三种标志物mRNA进行半定量检测其表达量。取干预组和空白对照组细胞用不含血清的DMEM/F12培养基诱导2h,观察两组细胞的形态学变化,并使用免疫细胞化学染色方法检测干预组及空白对照组诱导后NSE、Nestin的表达情况。同时使用RT-PCR方法对细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)三种标志物mRNA进行半定量检测其表达量。结果经过3次传代的F3代贴壁细胞经流式细胞仪检测CD71、CD90、CD29表达阳性,CD45为阴性,免疫细胞化学染色方法鉴定标志物CD90、CD71表达阳性。在加入bFGF干预后,可以观察到细胞增殖速度有所加快,2-3d传代一次,光镜下观察细胞形态学可以发现胞体变得更加细长,折光性增加。利用免疫细胞化学染色检测干预组与空白对照组特异性神经标志物的表达情况,镜下可见,干预组不同浓度神经诱导后NSE、nestin表达阳性,各干预组之间阳性率未见明显差异。而空白对照组NSE、nestin阳性率较低无统计学意义。提取干预组与空白对照组的细胞总RNA,利用]RT-PCR技术进行检测,各组细胞均可检测到nestin,βⅢ-tubulin. NSE mRNA的表达,但干预组表达水平明显高于空白对照组,干预组组各浓度组之间表达水平未见明显差异。干预组BMSCs在使用无血清培养基后1h胞体即可观察到缩短,折光性增加,形成数个突出,并随诱导时间逐渐变得形状不规则,呈双极或多极,2小时后细胞形态已基本类似神经样细胞,而空白对照组组与干预组相比,使用无血清培养基后细胞形态发生改变的时间较晚,改变后细胞形状与对照组相似,但神经样细胞的比例较干预组为低。对无血清诱导的干预组与对照组细胞应用免疫细胞化学染色检测后,发现各组诱导后产生的神经样细胞均有神经细胞标志nestin、 NSE表达。提取无血清培养基诱导分化后的干预组与空白对照组细胞总RNA,行RT-PCR检测,各组细胞均可检测到nestin、βⅢ-tubulin、NSE mRNA的表达,但干预组表达水平明显高于空白对照组,干预组组各浓度组之间表达水平未见明显差异。讨论：本次实验应用贴壁培养、24h后即进行初次换液以及控制消化等多种方法对大鼠BMSCs进行更为有效的分离与培养,第3代BMSCs通过流式细胞仪及免疫荧光细胞化学法检测细胞分子CD90、CD71、CD29均呈阳性,而细胞分析CD45为阴性,证实了经过分离培养的原始骨髓细胞最终成为较为均一的BMSCs。使用无血清培养基培养的方法可以诱导空白对照组和干预组的BMSCs分化为具有神经细胞形态的神经样细胞,免疫荧光细胞化学染色及RT-PCR的结果表明,无论空白对照组或干预组均有作为神经细胞特异性标志物的βⅢ-tubulin、nestin、NSE的表达,说明有神经样细胞分化。同时也说明了bFGF对BMSCs向神经样细胞分化的过程中起到了增殖和诱导的作用,提高了BMSCs向神经样细胞诱导分化的转化率,为进一步临床应用提供了一定的理论基础。