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弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplas gwondii)引起的呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,具有广泛的宿主群,能感染包括人类在内的几乎所有恒温动物,据估计,全球三分之一的人患有弓形虫病。由于弓形虫生活史的复杂性及其宿主的多态性,迄今为止,尚无有效、安全的疫苗及药物用来抵御弓形虫的感染。GRAs为弓形虫致密颗粒泡内细胞器分泌的一类具有免疫活性的蛋白质,被认为是一种排泄分泌性抗原(excreted secreted antigens,ESA),相对分子质量都较小,在修饰调理纳虫泡中和和修饰泡内网络结构起重要作用,参与到虫体在细胞内的存活和复制的过程中,与虫体存活和毒力相关。GRA16无内含子,1518 bp,N-端其信号肽序区,C-端为跨膜区。GRA16在宿主细胞内与HAUSP和PP2A相互作用,破坏宿主细胞的结构,改变宿主细胞基因的表达。GRA16蛋白在宿主体内,通过调节糖皮质激素介导炎性反应因子p 53的水平,从而影响NF-κB的信号途径。GRA16同时也作为弓形虫II型虫株的毒力关键因子,能够调节细胞的循环和新陈代谢。弓形虫细胞核因子TgNF3坐落在细胞核上,为弓形虫新陈代谢、转运、翻译的调节因子,从而影响细胞核的结构和虫子的毒力。为了研究弓形虫GRA16和TgNF3作为抗弓形虫疫苗的候选抗原的可行性和进一步研制商用应用型的抗弓形虫疫苗寻找思路,本次研究首先通过分析14株不同宿主和地理来源的弓形虫虫株的GRA16基因的遗传变异情况。发现TgGRA16基因的基因组变异率很低,变异率为0~1.12%之间。研究结果显示GRA16蛋白较为保守,适合作为抗弓形虫疫苗的候选分子,尤其是对弓形虫II型虫株,可产生良好的免疫保护效果。运用相关的分子生物学软件分析预测TgNF3基因的生化特性,发现为TgNF3基因具有良好的抗原特性,提示TgNF3的亚单位疫苗具有抵抗不同基因型弓形虫感染的免疫保护效果。对GRA16,TgNF3两个基因编码的氨基酸序列,利用生物信息学方法进行结构分析和抗原表位预测,表明这两个蛋白结构中含有数量不等的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。通过综合分析这两个蛋白的柔性区和表面氨基酸序列,预测GRA16和TgNF3分别含有6个和9个B细胞抗原表位,提示这两个蛋白具有较强的免疫原性,是较为理想的抗弓形虫疫苗的候选抗原分子。分别将GRA16、TgNF3基因连接到真核表达载体pVAX I后制备核酸疫苗免疫小鼠,于三免后检测评估其诱导小鼠产生的免疫应答反应和免疫保护效果。结果表明:GRA16、TgNF3疫苗均能引发免疫小鼠产生强烈的Thl型体液和细胞免疫应答反应。三免后14 d,以弓形虫RH株速殖子和PRU株人工攻击感染小鼠后发现,对弓形虫RH株急性感染的GRA16和TgNF3疫苗组小鼠存活天数分别延长至8.4 d和9.5 d;对PRU株慢性感染的GRA16和TgNF3疫苗组的小鼠的脑弓形虫包囊数量分别减少了 43.89%和32.87%。表明GRA16、TgNF3抗原具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生较强的免疫应答以及抵抗弓形虫的感染。本次研究首次以实验证明了弓形虫GRA16、TgNF3基因具有较强的免疫原性,能有效抵抗弓形虫的攻击感染,是较为理想的抗弓形虫疫苗的候选分子,为今后研制实用性的抗弓形虫疫苗奠定的理论基础。