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咽炎是耳鼻喉科常见的一种疾病,咽炎引起的病理改变严重时会影响机体的其它机能,对人们的身体健康造成威胁。当前对于咽炎的治疗多采用抗生素等药物,很容易产生耐药性,而且一些药物还会产生负面作用。泰山灰树花(Grifola frondosa)是在泰山特殊地理环境和气候条件下形成的一种珍稀食药用真菌,民间多用于治疗咽炎、扁桃体炎等疾病。如果以泰山灰树花作为原料,从中分离鉴定出既可以治疗咽炎又无毒副作用的物质,这将对人类的身体健康产生深远的影响,具有重要的科学研究价值。 本研究以泰山灰树花为试验材料,探讨了其母种、液体菌种和栽培出菇的最佳条件;然后以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)为指示菌,以泰山灰树花子实体为试验材料,利用一系列纯化方法,对泰山灰树花中治疗咽炎的活性物质进行分离鉴定;最后,利用大鼠细菌性咽炎模型对活性物质进行了验证,并研究了泰山灰树花治疗咽炎的初步机理。通过以上试验,取得以下结果: 1.泰山灰树花母种的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏,培养基内添加栗树木屑浸出液有利于菌丝的生长,菌丝生长的最适酸碱度为pH6.0,最适温度为24℃;液体菌种的最佳培养条件为:转速120r/min,接种量20mL,温度24℃;栽培种的最佳培养基配方为:栗树木屑45%,棉籽壳33%,麦麸20%,石膏1%,白糖1%;栽培种最适发菌温度为24-28℃;出菇时需要进行覆土处理;出菇的适宜温度为20-24℃,相对湿度为90%。 2.泰山灰树花发酵液和菌丝球对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性,子实体对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性,但泰山灰树花子实体内多糖对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。利用水抽提、硫酸铵沉淀、pH3.5类等电点沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对泰山灰树花中的活性物质进行分离纯化,并用SDS-PAGE检测活性物质的纯度及分子量,最终确定泰山灰树花中治疗咽炎的活性物质是分子量为71KDa等分子量双亚基蛋白质,命名为GFP。 3.通过肽段测序,获得GFP中的五个肽段序列,分别为:NHNADTSNSQEFYR(GFP1)、QYAEIVGTPAEVPYWSFGFHQCR(GFP2)、KHHQTYVNALNAAEQA YAK(GFP3)、HHQTYVNALNAAEQAYAK(GFP4)、EFNATTASIQGSGWGWLGLNPTTK(GFP5),前两个序列与α/β葡萄糖苷酶序列相似,后三个序列与MnSOD中的保守序列相似;通过测定GFP的N端序列,得到其N-末端部分氨基酸序列为:AVRPLAAGVY(丙氨酸-缬氨酸-精氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸)。通过对GFP理化性质的测定,得到GFP最适温度为40℃;在pH2-11的伯瑞坦-罗比森缓冲液中相对活性保持在为80%以上,对pH有较宽的稳定性;10mM Ca2+、Ba2+、K+、Mg2+对GFP抑菌活性具有一定的激活作用,尤以K+最为显著,相对活性高达139%;10mM Na+、Fe3+、Zn2+、Al3+和Cu2+对GFP的活性具有抑制作用,其中Al3+和Cu2+的抑制作用达100%;进一步试验证明,0.625mM Al3+和Cu2+对GFP无影响,当浓度高于0.625mM时,能够抑制GFP的活性。GFP对有机溶剂甲醇、乙醇和异丙醇敏感,对氯仿不敏感;通过硫酸-苯酚法测得该GFP的含糖量为3.15%。 4.通过金黄色葡萄球菌感染大鼠口腔粘膜成功建立了大鼠咽炎模型。经验证,GFP对大鼠细菌性咽炎有较好的治疗效果,且呈现剂量依赖关系。通过对大鼠表观观察、咽部组织病理形态学观察、炎症因子的测定等数据进行分析,初步得出泰山灰树花治疗大鼠细菌性咽炎的机理为:泰山灰树花活性蛋白GFP能抑制金黄色葡萄球菌的生长,改善咽炎大鼠的精神状态及毛色光泽度,降低咽部粘液分泌量,使咽部粘膜变薄且有光泽,减轻口腔粘膜的肿胀充血;明显降低大鼠口腔粘膜组织的病理形态学的变异,缓解粘膜角质化趋势,减轻钉突现象,维持粘液腺的完整性;抑制血管内皮细胞的渗透,有效对抗炎细胞的浸润和蔓延,减少体内促炎性细胞因子的生成,从而减轻炎症症状。 通过以上试验,首先确定了泰山灰树花母种及栽培种的最优培养条件,且在实验室条件下成功进行了人工栽培。通过一系列方法明确泰山灰树花中抗细菌性咽炎的物质为蛋白质,揭示了泰山灰树花治疗咽炎的分子机理,具有重要的科学意义。